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扬州大学李维维组牵头在猪瘟病毒蛋白结构领域取得新进展
at :2018/5/16 9:02:06    

近日,扬州大学李维维研究组协同复旦大学及美国Indiana大学专家在猪瘟病毒(CSFV)蛋白结构领域取得新进展。首次得到了猪瘟病毒NS5B的蛋白晶体,并且解析了猪瘟病毒NS5B蛋白的三级结构,且在其N端发现了一个特异的N terminal domain (NTD)。李维维研究小组通过一系列的生化实验证实该NTD 在NS5B的RNA 聚合酶功能上具有重要作用,或帮助抓捕RNA template,影响NS5B的聚合酶活性,进而影响病毒致病力。该成果在线发表在国际病毒学期刊Journal of Virology上,原文题为"A Crystal Structure of Classical Swine Fever Virus NS5B Reveals a Novel N-terminal Domain"。

原文网址:

http://jvi.asm.org/content/early/2018/04/26/JVI.00324-18.abstract
 

猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV),属于黄病毒科瘟病毒属,是影响我国畜牧产业的重要病原体之一[1]。猪瘟病毒是单股正链RNA病毒,转录翻译包括NS5B在内的共12个病毒蛋白,包括Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。NS5B(Nonstructural protein 5B, NS5B),不仅对猪瘟病毒的复制增殖起重要作用,同时,NS5B功能异常也是病毒RNA突变体出现的直接原因[4]。目前防控猪瘟的主要措施是接种猪瘟兔化弱毒疫苗和扑杀病猪等方式,尽管如此,猪瘟仍时有发生,对养猪业造成了巨大损失[2,3]。

 

NS5B是依赖RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp),在CSFV的RNA复制起始阶段,RdRp和GTP结合到RNA聚合酶上以启动RNA合成。NS5B蛋白结合病毒的正链RNA之后催化合成互补的负链RNA,再以负链RNA合成病毒新的子代正链RNA基因。NS5B在病毒复制周期中起着至关重要的作用,它参与形成复杂的RNA复制体,但猪瘟病毒RNA聚合酶的起始合成机制及其酶活性位点目前仍未明晰。因此,研究并明确猪瘟病毒的复制增殖机制并找到相关的抑制位点是寻找新型抗病毒手段的前提。

 

目前,黄病毒科中包括丙型肝炎病毒(HCV)在内的多种病毒的RNA聚合酶的三级结构已经得到解析,相关的研究结果已经应用于相应的抗病毒治疗手段。然而,猪瘟病毒NS5B的RNA聚合酶活性研究甚少,近年来虽有体外表达猪瘟病毒NS5B蛋白的报道,但是猪瘟病毒NS5B三级结构研究仍然是零报道。

 

扬州大学比较医学研究院李维维老师联合美国印第安纳大学及复旦大学研究人员,基于 CSFV-NS5B结构揭示了一个典型的RdRp聚合酶体系结构,其中包含手指、手掌和拇指域(图1)由CSFV-NS5B推导出的RNA复制起始包含:模板结合,起始复合物的形成,以及从起始到延伸的过渡。首先,指尖区域位于RNA模板通道口附近,它的功能是控制和帮助模板的插入。CSFV-NS5B的指尖区域也可以控制rNTP进入,并诱导RdRp扩展其模板隧道。通过体外针对指尖区域的突变体的体外聚合酶分析验证了“指尖区域”的功能。其次,在CSFV-NS5B(也称为启动元素)的拇指域中,“拇指区域”与C-端多肽的一部分结合在一起,在控制模板通道的容量中起着重要作用。在由指尖区域选定的第一个rNTP的帮助下,催化复合体将形成。启动回路的构象变化将使模板隧道扩大到适当的容量,以确保只允许单链RNA进入聚合酶的活性部位。启动环可以是一个延伸的循环结构,例如Flavi病毒性NS5,或一个发夹结构,如HCV-NS5B,甚至是螺旋模块,如噬菌体6聚合酶。先前的研究表明,HCV-NS5B和DENV-NS5的启动元素的突变导致了从头起始RNA合成的减少。第三,Asp350可能是区别rNTP与dNTP的关键氨基酸,而不同的rNTP则是由Watson-克里克碱基对与模板RNA配对的。第四,3’OH组的初级rNTP随后攻击新进入的rNTP的磷酸盐,形成一种新的磷酸二酯键。

 

 图1. CSFV-NS5B的结构揭示了一个新的NTD区域。(A)CSFV-NS5B与NADL和CP7的蛋白三级结构叠加图BVDV-NS5B-NADL是黑色的,BVDV-NS5B- CP7是灰色的。(B)NTD(12-88)的三级卡通图,着色为天空蓝。(C)蛋白三级结构叠加图显示CSFV-NS5B(91-135)与NADL和CP7的三级结构相似。(D)NTD的序列排列显示了一个新的N端区域(12-88)结构。CSFV的二级结构也同样着色为天蓝色。绿色的矩形表示在BVDV-NS5B-NADL中有一个发夹结构。(E)针对CSFVNS5B的N端体外截断型突变体实验证实,N端缺失的CSFV-NS5B的RNA聚合酶活性大大降低。

 

该CSFV-NS5B复合物结构的解析为抗猪瘟病毒药物的研发提供了坚实的结构基础,也为寻找新型的抑制位点提供了理论前提。

 

扬州大学李维维作为课题主要完成人为论文的第一作者及通讯作者,复旦大学吴柏兴博士为论文共同第一作者。该研究得到了国自然青年基金(31602054)、中国博士后基金第61批面上资助(2017M611455)、江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)及江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心的资助。

                                           

参考文献:

1. Li W, Wang G, Liang W, Kang K, Guo K, Zhang Y. 2014. Integrin beta3 is required in infection and proliferation of classical swine fever virus. PLoS One 9:e110911.

2. Dreier S, Zimmermann B, Moennig V, Greiser-Wilke I (2007) A sequence database allowing automated genotyping of Classical swine fever virus isolates. J Virol Methods 140: 95-99.

3. Lin M, Trottier E, Pasick J (2005) Antibody responses of pigs to defined Erns fragments after infection with classical swine fever virus. Clin Diagn Lab Immunol 12: 180-186.

4. Li W, Zhang Y, Kao CC. 2014. The classic swine fever virus (CSFV) core protein can enhance de novo-initiated RNA synthesis by the CSFV polymerase NS5B. Virus Genes 49:106-115.

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