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复旦大学袁正宏组揭示外泌体传递IFN-α诱导的抗病毒效应进入肝细胞的机制
at :2018/10/22 9:04:17    

近日,复旦大学袁正宏教授团队在前期工作的基础上,揭示了外泌体利用病毒入侵的分子机制传递IFN-α诱导的抗病毒效应进入肝细胞的详细机制。相关成果在线发表在国际病毒学期刊Journal of Virology上。原文题为“Exosomes exploit the virus entry machinery and pathway to transmit IFN-α-induced antiviral activity”。
 

乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎仍是危害人类健康的重大问题。慢性乙肝有较高的风险进一步发展为肝硬化,甚至肝癌。干扰素-α(Interferon-α, IFN-α)是临床上乙肝治疗的主要手段之一,直接的抗病毒效应和间接的免疫调节是干扰素抗乙肝的重要基础,其详细的分子机制一直是国内外学者研究的重点和热点。本课题组前期的研究发现巨噬细胞在内的肝非实质细胞(nonpermissive liver nonparenchymal cells,LNPCs)可通过外泌体(exosome)传递IFN-α诱导的抗病毒效应至HBV复制的肝细胞中,反拮抗病毒对IFN-α抗病毒活性的干扰,从而有效抑制HBV在肝细胞中的复制,但外泌体是依赖何种机制进入肝细胞以传递IFN-α诱导的抗HBV效应有待深入阐明

 

本研究中,袁正宏团队首先发现巨噬细胞来源的外泌体可以借鉴病毒入胞的分子机制进入肝细胞,从而传递IFN-α诱导的抗HBV效应。巨噬细胞外泌体将凋亡标志物磷酯酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PtdSer)暴露于表面,通过类似病毒“凋亡模拟”的方式,经甲肝病毒受体TIM-1 (T cell immunoglobulin and mucin receptor 1)进入肝细胞。进一步实验证明TIM-1在外泌体入胞以及传递抗病毒活性中也起了关键作用,抑制TIM-1在HBV复制细胞系HepG2.2.15中的表达阻碍了外泌体对IFN-α诱导的抗HBV活性的传递。

 

后续实验证明与病毒入胞密切相关的网格蛋白介导的内吞(CME)及大胞饮也是巨噬细胞外泌体进入肝细胞的主要内吞途径。使用CME抑制剂氯丙嗪或者敲低肝细胞中网格蛋白重链(clathrin heavy chain, CHC)的表达均可有效抑制外泌体进入肝细胞(图1)。此外,将肝细胞与巨噬细胞外泌体共孵育可以刺激肝细胞的液相内吞(fluid-phase uptake),而液相内吞的增强被视为大胞饮发生的标志,应用大胞饮经典抑制剂EIPA及大胞饮相关丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂均能显著抑制巨噬细胞外泌体进入肝细胞。然而出乎意料的是, Rac1及Cdc42突变并不影响肝细胞对巨噬细胞外泌体的摄取,这说明外泌体有可能是通过Rac1及Cdc42不依赖的非典型大胞饮方式进入肝细胞。同理,抑制CME及大胞饮后可阻碍巨噬细胞外泌体传递IFN-α诱导的抗病毒效应至HBV复制的肝细胞

 

图1 外泌体网格蛋白介导的内吞进入细胞。

 

进一步深入研究发现,内吞入肝细胞的巨噬细胞外泌体会与内体界膜融合以便释放其内容物,逃逸溶酶体降解,这与病毒内体穿透(endosome penentration)的机制类似。活细胞成像捕捉到了内吞入肝细胞后,膜融合探针R18 (hydrophobic dye rhodamine C18)标记的外泌体所发出的膜融合荧光信号,其与标记的晚期内体(late endosome, LE)标志蛋白RAB7,及多囊泡体(multivesicular body, MVB)标志蛋白CD63有共定位(图2)。同时发现,参与病毒内体穿透的重要脂质LBPA(lysobisphosphatidic acid)在巨噬细胞外泌体的膜融合中也起着重要作用,使用特异性抗体封闭肝细胞内的LBPA可以显著抑制巨噬细胞外泌体的膜融合从而促进外泌体内容物向溶酶体的转运

 

图2. 内吞入肝细胞的巨噬细胞外泌体会与内体界膜融合以便释放其内容物。

 

这项研究从结合受体、内吞至潜在的内体逃逸,深入揭示了巨噬细胞外泌体传递IFN-α抗病毒效应入肝细胞的具体机制,发现外泌体与病毒在入胞机制上的相似点,证明巨噬细胞外泌体可以通过病毒受体(TIM-1)、病毒常用的内吞通路(CME及大胞饮),以及最后依赖病毒内体穿透机制(LBPA依赖的内体膜融合)传递IFN-α诱导的抗HBV活性。这项工作也为改造外泌体成运输抗病毒分子的高效治疗性载体提供了理论基础。 

 


该研究以袁正宏团队前期发表于Nature Immunology的工作“Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity”为基础,并得到国家自然科学基金,国家重大科技专项以及国家重点研发计划的资助。此次发表的研究论文,姚真蓝乔云圣为共同第一作者,袁正宏李建华为共同通讯作者。该室陈捷亮、沈芳、白露博士以及博士研究生李晓芳、丁家惠、施碧胜也为该研究作出了重要贡献。

 

近日,袁正宏课题组还与复旦大学附属公共卫生临床中心科学研究部慢性乙型肝炎研究组、肝炎科、华山医院传染病研究所合作在Journal of Virology上刊登了“Extracellular HBV RNAs are heterogeneous in length and circulate as capsid-antibody-complexes in addition to virions in chronic hepatitis B patients”的研究成果。该研究揭开了乙肝病毒RNA分子在患者血清中的神秘面纱。

 

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