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武汉病毒所与南开大学、天津国际生物医药联合研究院筛选得到沙粒病毒入侵抑制剂 | Protein Cell
at :2019/1/21 9:19:35    
近日,中国科学院武汉病毒研究所/病毒学国家重点实验室肖庚富研究组与南开大学药学院、天津国际生物医药联合研究院合作在Protein & Cell杂志上发表题为“Structure-Activity Relationship Optimization for Lassa Virus Fusion Inhibitors Targeting the Transmembrane Domain of GP2”(靶向拉沙病毒GP2跨膜区融合抑制剂的构效关系优化及其机制研究)的研究论文。该研究成功筛选得到四种阻断四级病原拉沙病毒(Lassa virus, LASV)入侵的抑制剂:化合物21、29、57、72,并对其作用机制进行了详细阐述。
原文链接:
https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-018-0604-x

LASV属沙粒病毒科(Arenaviridae)、哺乳类沙粒病毒属(Mammarenavirus),被该病毒感染可引发烈性传染病拉沙热,被美国疾控中心归类为A类生物恐怖病原(Category A bioterrorism agent)。LASV的天然宿主是啮齿类多乳鼠,人主要通过接触含有病毒的动物排泄物或气溶胶感染,人与人之间也会相互传播。LASV主要在西非地区流行,每年约 30 万-50 万人被感染,住院患者中致死率最高可达70%,幸存者往往也会伴有耳聋等严重后遗症。今年年初,尼日利亚爆发了该国史上最严重的一次拉沙热疫情,从1月1日到4月29日,已有420 人确认感染拉沙热,114 人死亡。目前还没有 FDA 批准的针对 LASV 的特效药物和疫苗,治疗手段仅限于在感染早期使用广谱抗病毒药物利巴韦林。因此了解LASV的致病机制,发展针对LASV的治疗手段非常必要。

病毒入侵是病毒生命周期的第一步,是抗病毒药物设计的重要靶点之一。LASV病毒囊膜糖蛋白GPC(glycoprotein complex)由滞留信号肽(SSP)、GP1(参与受体识别)、GP2(参与膜融合)组成,由SSP和GP2构成的SSP-GP2互作界面是进入抑制剂的主要靶点。我们构建了以水泡性口炎病毒(VSV)为骨架、外面包裹LASV 囊膜糖蛋白 GPC(glycoprotein complex)的具有单次感染能力的假型病毒(LASVpv)和能产生子代病毒、重复感染的重组病毒(LASVrv),LASVpv和LASVrv由于囊膜蛋白与 LASV 相同,因此可以在生物安全二级的条件下模拟 LASV 的入侵过程。且由于其携带报告基因,便于高通量筛选。

我们通过对已报道的由SIGA公司筛选的LASV特异性进入型抑制剂ST-161进行构效关系(Structure-Activity Relationship)优化,得到72种衍生物。通过在不同细胞上进行LASV假病毒和重组病毒的抗病毒实验鉴定出四种LASV进入抑制剂:命名为化合物21、29、57、72,其细胞半数致死剂量IC50分别为18.92 pM、189 pM、0.2784 pM、20.08 nM。令人惊喜的是,抗病毒效果最好的化合物57对沙粒病毒科其他四级病原也有显著抑制效果,其中对胡宁病毒(Junín virus)、沙比亚病毒(Sabiá virus)、查帕雷病毒(Chapare virus)的抑制水平达到纳摩级;对瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus )和马丘波病毒(Machupo virus)的抑制水平更是达到皮摩级,有望成为沙粒病毒的广谱性抑制剂(图1)。

 
图1 四种最优LASV进入抑制剂21、29、57、72的抗沙粒病毒效果对比

为进一步的探索四种化合物的作用机制,我们通过膜融合实验,证明四种化合物均能显著抑制LASV GPC介导的膜融合。且发现化合物57也能显著抑制JUNV/SABV/CHAPV/GTOV/MACV GPC介导的膜融合,从而抑制病毒的进入。接着通过LASV病毒耐药株筛选,发现抑制剂21的耐药点突变是GP2跨膜区(TM)的第428位的亮氨酸(L)突变为丝氨酸(L428S),抑制剂29、57、72的耐药点突变是GP2跨膜区的第446位的苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(F446L)。研究发现L428S和F446L及其联合突变假病毒对四种抑制剂均有显著耐药效果。

进一步研究发现耐药点突变L428S和F446L都是位于GP2跨膜区α螺旋的同一侧,因此,我们猜想GP2跨膜区存在药物的耐药性/敏感性界面,接下来我们对GP2 TM进行丙氨酸扫描膜融合实验并通过化合物29鉴定其敏感性,结果发现GP2 TM α螺旋针对化合物29明显的划分为耐药性/敏感性界面(图2)。

 
图2 LASV-GP2跨膜区的抑制剂敏感性/耐药性界面鉴定

我们的实验证明四种化合物可以显著抑制LASV的进入,相比于ST-161,显著提高了抗病毒效果,且具有广谱的抗病毒活性。其作用机制是通过作用于SSP与GP2的相互作用界面,稳定GPC融合前的构象,抑制膜融合而达到抗病毒的效果。以上研究为为抗沙粒病毒的药物研发提供了理论依据与优化策略。

南开大学与武汉病毒所联合培养硕士研究生张光顺为本文第一作者,武汉病毒所副研究员王薇为通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划(2018YFA0507204)、国家自然科学基金(31670165)、武汉国家生物安全实验室高端用户培育项目课题暨中国科学院高致病性病原生物学与生物安全重点实验室开放研究基金课题(NBL2017008)、病毒学国家重点实验室开放课题(2018IOV001)资助。

 

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