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1994年09卷4期

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Review

通用引物PCR技术的应用概况

陈火胜

1994, 9(4): 279

多聚酶链反应(PCR)技术自8O年代中期问世以来,获得了迅速的发展和广泛应用,已成为医学生物学、分子生物学的有力工具。但随着该技术应用的普及和深入,某些新问题也越来越突出。其中,关键问题之一是引物。引物设计的合理与否,合成纯化质量的好坏,直接关系到PCR反应的成败。不少实验室已花费大量时 和昂贵资金用于各种特异引物的设计与台成 ]。生物种类是如此繁多,桉酶序列义是千差别,以致有大量核酸片段无财力按已知序列设计合成引物后扩增。于是,探索通用引物部分代替特异引物,建立通用引物PCR技术成了具有挑战性和吸引力的弹题。这方面的努力已取得了一些重要进展,按作者理解可划分三类通用引物 ,现简要分述如下。

核酶(Ribozyme)在剪切病毒核酸中的应用

陈士友, 金由辛

1994, 9(4): 283

Ribozyme是一类具有酶活性的RNA分子,在自然界中较为普遍存在。许多天然的RNA中 存在多种自我剪切型的Ribozyme结构,通过特定结构的形成,这些RNA发生自我剪切反 应。所有这些自体剪切型的结构都可转化为分子M的剪切反应,而这些催化分子问剪切反应 的Ribozyme有可能成为阻断病毒基因和其它有害基因表达的工具。现简单介绍近年来Rf bozyme在剪切病毒核酸方面的进展。

多聚酶链反应检测宫颈HPV感染及分型的研究

蔡红, 姚堃, 陈伟丽, 周瑶玺, 杨志坚

1994, 9(4): 291

本文应用PCR技术检测2l2例临床宫颈标本的HPV-6、ll、16、18型特异性核酸序列。结果发现HPV-DNA的阳性率:宫颈癌组为62.5%(25/40).慢性宫颈炎为57%(81/142),正常宫颈对照组为20%(6/30),P<0.001,提示HPV的感染与宫颈炎、宫颈癌有关。同时分型结果显示:HPV-6、16、18型与宫颈炎相关,16型与宫颈癌密切相关,且HPV不同型别的混合感染在宫颈中普遍存在(31.3%)。成年女性各年龄组间HPV的感染率并无明显差异(P>0.05)。

丙型肝炎病毒非结构3区基因片段的克隆表达及抗原纯化鉴定

李越希, 唐家琪, 陶开华, 乔仁良, 李先富, 潘秀珍

1994, 9(4): 297

通过逆转录PCR技术,从中国江苏省丙型肝炎病人血清中扩增克隆了丙型肝炎病毒(HCV)的非结构3区的部分基因片段(C33)。DNA序列分析证实,该片段全长842bp。在合成的一对逆转录PCR引物上,上游引物增加了NcoⅠ酶切位点(内含起始密码子ATG),下游引物上增加了SalⅠ酶切位点及终止密码子TAA,将克隆的C33基因片段克隆至表达载体pBV221内,获得了表达C33抗原的工程菌,表达C33抗原分子过为30kD,经尿素裂解纯化、分子筛分离纯化及复性后进行离子交换和反相亲和层析纯化,获得的重组蛋白经ELBA和免疫印迹等证实有较好的抗原性和特异性。

HBIG、无环鸟苷、干扰素联合对慢性乙型肝炎抗病毒效应观察

黄华芳, 熊开钧, 曾令兰, 何生松, 杨泽川

1994, 9(4): 304

本文报道血清HBV复制标志阳性的慢乙肝54例,随机分为治疗组及对照组各27例进行HBIG、无环鸟苷、干扰素联合近、远期抗病毒效应观察。治疗组为无环鸟苷第一周按25~20mg/kg/d计后改17~15mg/kg/d×53天,共60天;人白细胞干扰素1×106U肌注每周3次×4周,后改1.0×106U肌注每周2次×6周,共10周;HBIG400U肌注隔日1次,共10周,对照组仅给予一般“保肝”药物。其中治疗组18例,对照组19例进行治后半年到2年追踪观察,结果近、远期HBcAg、DNAP、HBV-DNA阴转率治疗组均高于对照组,其中治疗组近、远期HBcAg,HBV-DNA阴转率均达40%以上,明显高于对照组(P<0.05~0.01),治疗组近、远期各有4例及2例HBsAg阴转,而对照组则无一例阴转,从近、远期综合抗病毒效应观察,治疗组全阴率分别为33.3%、44.4%,而对照组分别为3.79%及0%,P<0.01,治疗组无明显毒副反应。对比单用无环鸟苷,全阴率31.8%;无环鸟苷加干扰素两药联合全阴率37.5%,均有所提高,达到44.4%,值得进一步研究。

棉铃虫(Heliothisspp)核型多角体病毒四个分离株的比较研究

孙修炼, 张光裕

1994, 9(4): 309

本文从形态结构、生物活性、结构多肽、核酸限制性内切酶图谱和核酸同源性等方面对棉铃虫核型多角体病毒四个分离株(两个SNPV分离株:HaS、HzS,和两个MNPV分离株:HaM1、HaM2)进行了比较研究。它们对中国棉铃虫二龄末三龄初幼虫的LD50佰依次为361、387、2633、3560PIBs/克饲料,当感染剂过为5×l03PIBs/克饲料时,其LT50值依次为4.6、4.9、6.4和6.6天。两个SNPV分离株的生物活性显著高于两个MNPV分离株。经SDS-PAGE分析,四个分离株多角体蛋白均为一条带,两个MNPV分离株结构多肽均具有相同的迁移率,两个SNPV分离株的结构多肽图谱也颇相似,但SNPV与MNPV分离株之间带型相差较大。各分离株基出组经BamHI、EcoRI、HindⅢ和XbaI消化后,得到的内切酶图谱表现为两个NMPV分离株一致,两个SNPV分离株也很相似,而SNPV与MNPV分离株之间相差很大。严格条件杂交结果表明:两个SNPV分离株的基因组有较高的同源性,而SNPV与MNPV基因组之间的同源性极低。

含卫星RNA的黄瓜花叶病毒弱株系的分离鉴定及在病毒病防治上的应用

周雪平, 濮祖芹, 方中达

1994, 9(4): 319

从豌豆上分离获得黄瓜花叶病毒分离物CMVP1,摩擦接种9科29种植物,CMVPl在大多数植物上症状很轻或无任何症状,提纯的病毒颗粒为球形,直径约28nm,病毒衣壳蛋白亚基分子量约27.5kD,所含核酸有五个组份,即CMVP1含有卫星RNA。CMVP1接种三生烟后8-12天内呈轻花叶,此时组织中病毒含量最高,随后症状消失,去除卫星RNA能加重CMVP1在番茄上的症状,因而是卫星RNA减轻了CMVPl的病状。当CMVP1保护接种番茄后攻强毒,番茄发病率低,病情轻,保护率达90%以上,并有一定的刺激生长作用,还能提早开花4天,植株结果数增多,成熟果实的颜色、形态、品质和重量均正常。CMVP1对烟草亦具有很好的保护效果。保护接种的植株能明显减少强毒株侵染,可减少90%以上。

蚕豆萎蔫病毒——新疆番茄分离株的鉴定

周俊, 尹玉琦, 崔星明, 李国英, 李维琪

1994, 9(4): 327

在新疆番茄斑驳病株上分离出一种球状病毒,回接到番茄上产生斑驳症状。病毒粒体为20面体,平均直径25nm。经汁液摩擦接种可感染昆诺阿藜、苋色藜、蚕豆、番茄等18种植物,不感染菜豆、豇豆、豌豆、六叶茄、黄瓜等。可由桃蚜传毒。在琼脂双扩散试验中,能与蚕豆萎蔫病毒(BBWV)抗血清产生明显的沉淀线,与豇豆花叶病毒(CpMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)抗血清均不发生反应。纯化病毒紫外扫描呈典型的核蛋白吸收叫线,病毒衣壳蛋白由两种蛋白亚基构成,其分子量分别为45900和20400道尔顿,由18种氨基酸约255个氨基酸残基组成。病毒核酸是双组份的,它们的分子量为1320000和2340000道尔顿。根据上述结果认为该病毒是蚕豆萎蔫病毒侵染番茄的一个株系。

大蒜花叶病毒外壳蛋白基因cDNA的克隆和序列分析

范永坚, 吴淑华, 陆振晓, 许政

1994, 9(4): 333

我们从自然发病的大蒜中分离得到了大蒜花叶病毒。以其基因组RNA为模板合成了3'末端部分cDNA。从中选出一批插入片段在2.0kb以上的重组克隆,经Northern点杂交分析证实了所选克隆与基因组RNA同源。通过对若干个克隆的插入片段两端部分序列的测定,选出一个克隆pGM495,其插入片段的长度约为2.4kb,3′末端存有一个Poly(A)结构,它应包含了编码该病毒外壳蛋白全部序列。序列测定的结果表明,这个cDNA片段全长为2379bp,其中含有与酶切图谱分析结果相符的EeoRI、PstI及BamHI酶切位点。第一个终止密码子TAA与3′g末端相距264bp,我们根据碱基序列推定的氨基酸序列与其它已发表的Potyvirus的外壳蛋白氨基酸序列以及外壳蛋白翻译后加工的蛋白酶专一切点相比较后推测,编码该病毒外壳蛋白序列可能起始于3′末端上游的1170bp处,共编码302个氨基酸,其分子量为36kD,略大于SDS-PAGE所测定的33kD,非编码区域长264bp,富含AT,并有多个终止密码子的存在。趾3′末端32~27bp处有一个AATAA序列。

真菌传杆状病毒组(Furovirus)内四种病毒的细胞病理学比较研究

李毅, 魏春红, 潘乃, 陈章良, 田波

1994, 9(4): 341

本文研究丁真菌传杆状病毒组(Furovirus)四个病毒成员,即甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)、甜菜土传病毒(BSBV)、花生丛生病毒印度株系(PCA-I)以及非洲株系(PCA-A)和小麦土传花叶病毒(SBWMV)所引起的细胞病理变化。这四种病毒在病毒粒子聚集的结构,是否引起细胞膜聚集及聚集的结构,过氧化物酶体泡状物的形成与否及结构均有差异。另外,同一种病毒的不同株系或分离物所引起的细胞病理变化也不相同。

伪狂犬病毒闽A株基因文库的构建及物理图谱分析

汪铭书, 郭万柱, 娄高明, 费恩阁, 宣华

1994, 9(4): 347

本文报道以质粒pBR322作载体,用鸟枪法克隆出了PRV闽A株除BamHI-1,2外的所有酶切片段,构建了PRV闽A株基因文库,并以克隆出的BamHI片段用光生物素标记作探针,应用分子杂交法确定了PRV闽A株绝大部分限制性内切酶位点的位置。

应用DIG标记探针杂交检测IBDV

陈士友, 陈溥言, 蔡宝祥, 金由辛, 王德宝, 张兹钧

1994, 9(4): 351

本试验用地高辛(Digoxigenin,DIG)标记的探针建立了核酸杂交检测传染性法氏囊病病毒(IB-DV)的方法,并在敏感性方面同琼脂扩散试验进行了比较。探针来源于IBDVSTC-ll9和STC-243cDNA。杂交方法的敏感性试验表明,核酸杂交可以检测到0.1pg的IBDVRNA;与多个毒株核酸的杂交则显示出标记的探针可以作为通用试剂用于IBDV早期感染的诊断;而同琼脂扩散试验的比较则说明,杂交方法比常规的免疫沉淀反应敏感104倍以上。除此之外,由于杂交方法特异以及非放射性探针操作方便,因而具有很大的应用前景。

草鱼出血病病毒多肽的基因定位

王炜, 蔡宜权, 方勤, 刘元文, 柯丽华

1994, 9(4): 356

用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的草鱼出血病病毒GCHV873的基因组ds-RNA的11个片段,分别在麦胚无细胞翻译体系中进行翻译。其翻译产物经SDS-PAGE系统分析。结果表明,基因组片段1、2、3、4、5、和10分别编码病毒核心衣壳的结构多肽VP1、VP2、VP3、VP4、VP5和VP10,片段6和7分别编码病毒外层衣壳的结构多肽VP6和VP7。片段8和9分别编码52kD和41kD的多肽,片段11编码两种多肽,分子量分别为29kD和19.5kD,它们与病毒结构多肽无明显对应关系。病毒基因组与多肽大体是一一对应的关系。

中国对虾非包涵体杆状病毒在体内的感染与发生

张建红, 陈棣华, 肖连春, 张立人, 高学兴, 吴志广

1994, 9(4): 362

在感染发病成虾的肝胰腺和中肠上皮细胞的胞核内,出现大量病毒发生基质,核衣壳,套膜和完全的病毒粒子。病毒粒子为短杆状,两端呈钝园形,平均大小约为250-300×l10nm,在核内无包涵体形成。在胞质内发现伴随病毒拉子并具有双层膜的蛋白质结构,这种结构建议称为该病毒的“封入体”。同时,我们认为这种无包涵体的杆状病毒,有可能应归属于杆状病毒科的第三个亚组。

AVWC-test在生命科学研究中应用效果的评估

董长垣, 陈冬娥, 王圣基, 应时, 陈晓

1994, 9(4): 367

AVWC-tcst是新近发展起来的生物统计方法,它能把非参数资料转变成参数资料进行定量统计分析。本研究进一步从国内外刊物上公开发表的学术论文中精选出了一定数量的研究数据,用AVWC-test方法进行统计处理,并与传统的非参数统计方法和计量资料统计方法进行同源自身对照,研究了其统计效能。结果清楚地表明:AVWC-test方法是一种应用面广,精确、灵敏、方便的生物统计分析方法,能更好地发掘科学资料的信息,提高研究效率。

绵羊进行性肺炎病毒荧光抗体的制备及其对病毒感染细胞的检测

丁恩雨, 相文华

1994, 9(4): 375

绵羊进行性肺炎(OPP)是慢性进行性传染病,以损害绵羊多种器官为特征,其病原为反转录病 毒科慢病毒亚科的成员。目前回外对本病的研究.特别是有关诊断方面的报道甚多, 而我国对OPP的研究尚处于起步阶段。本文旨在应用制备的OPP荧光抗体·按间接免疫荧光 法(间接IFA)米检测OPPV感染绵羊胎肺细胞岳的变化情况,为进一步阐明OPPV及其它慢病 毒的感染机理提供依据。

一株斜纹夜蛾核型多角体病毒毒力及基因组酶切的研究

王晓容, 刘明富, 刘润忠, 兰萍章, 张友清

1994, 9(4): 378

一株斜纹夜蛾核型多角体病毒毒力及基因组酶切的研究王晓容,刘明富,刘润忠,兰萍章,张友清(中国科学院武汉病毒研究所,武汉430071)关键词斜纹夜蛾,核多角体病毒,毒力测定,限制酶分析斜纹夜蛾(Spodopleralitura)是重要的农业害虫之一。关...