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2001年16卷2期

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Contents

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

黄文丽, 张海林, 王静林, 章域震, 周国林, 米竹青, 施华芳, 自登云, 粱国栋。

2001, 16(2): 97

本文对云南首次分离到的Sindhis病毒进行了滤过试验、耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血凝特 性、空斑和毒力等试验研究.结果符合披膜病毒科的病毒特性。交叉血抑试验和免疫荧光试验.以及空斑减少巾和 试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒。其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒 分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学 特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义
Research Article

Thl类细胞因子对pHCV.C重组体诱生免疫应答的增强作用

冯志华, 周永兴, 焦成松, 王全楚, 李谨革, 贾战生, 李文渡, 杜德伟

2001, 16(2): 101

为了探索Thl类细咆因子IL-2和IL一12对含丙型肝炎病毒(HCV)核 fl,(C)基因重组体诱生的免疫应答的增 强作用.本文构建了包含HCV C基因片段的重组质粒pHCV.C,将其单独或与Thl类细胞因子表达质粒pIL一2或 pIL12共免疫BAI B/c小鼠,El ISA法检测免疫小鼠血清中的HCV C特异性抗体滴度;以pHCV—C转染SP2/0细 胞.经筛选稳定表达HCV C抗原者(SP2/O HCV.C)为靶细胞. cr释放试验检测细胞毒T淋巴细胞(CTLs)的体外 特异性杀伤功能。结果发现,plI,2能够增加pHCV.C诱导的抗体产生.对CTLs的杀伤作用增强却不明显:而pII . 12对pHCV—c诱导的抗体和细胞免疫应答均有增强作用(D0 05) 由此推断,佐以Tht类细胞固子.不仅可 增 强基因疫苗诱生的免疫应答强度.而且可能使机体对基固疫苗的免疫应菩朝着有利于优先诱导CTLs免疫应答清 除病原体的方向发展。

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

钟彦伟, 成军, 施双双, 夏小兵, 李克, 董菁, 刘妍, 杨继珍

2001, 16(2): 105

采用噬菌体表面展示技术,以从乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原( Ag)阳性血清超速离心纯化的HBsAg为 圃相抗原.趴噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附洗脱一扩增 筛选过程.获得特异性较强的[-IB~Ag 人源单链可变区抗体(ScFv)克隆并提取质粒,经s I/,NbtI酶切鉴定后.亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转 化大肠杆菌XL1一Blue。经IPTG诱导后,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50%硫酸胺沉淀.经SDS—PAGE电泳 表明,XL1.Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28 kD。免疫活性检测结果表明,该单链抗体具有鞍强的 抗原结合活性和特异性 HmAg人源单链抗体的筛选和表达成功,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定厂 基础。

重组HIV表面抗原gpl20的表达纯化及免疫学鉴定

陈晨, 刘坤, 王金忠, 马明, 耿运琪, 陈启民, 朱效斟, 夏建珲

2001, 16(2): 109

为研制具有流行特点的H[V血清学诊断试剂,采用pET系统表达H[V.1表面糖蛋白gpl20 研究发现,垒 长的gpl20在E coli中不能有效表达;N端半长的gpl20可以表达,但表达量报低;仅保留N端1/3的gpl20(包含 gpl20 V1/V2抗原决定簇)有效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的18% ;Western blot显示较好的反应原性i通过金属 螫合层耔亍.产物得到完全纯化。在这些结果的基础上.我们表达了流行株的gpl20片段.探索 p120在大肠杆菌 的高效表达,建立针对中国人群的Hlv血清学诊断系统奠定基础。

庚型肝炎病毒NS5 cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

龚睿, 马辉文, 童立恒

2001, 16(2): 114

一段长度为880 bp的庚型肝炎病毒eDNA在太肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达。此eDNA被插入到表 达质粒pGEX-5X-I中,位于编码日本血吸虫答胱甘肽硫转移酶(GST)的DNA序列下游,并与GST处于同一阅读 框。用乳糖在37’C下诱导表达出以包涵体形式存在的GST-NS53融合蛋白,并用脲溶法提取了该蛋白;在20℃诱 导时,表达出的蛋白大部分可溶.用各胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱对可溶性的融合蛋白进行了纯化。免疫印迹 实验证明,此融合蛋白能被庚型肝炎病人的血清和自制的抗GST血清特异性地识别。用PC gene软件对NS53氨 基酸序列的亲水性和抗原决定簇进行了分析。本研究为庚型肝炎ELISA诊断试剂研制打下了基础。

检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用

徐焕宾, 责昆龙, 曾涛, 李劲光

2001, 16(2): 119

准确测定HIV一1的前病毒载量和病毒载量的技术.在感染者预后和芏滋病患者药物治疗效果的评价以及艾 滋病的其它研究方面,都具有十分重要的应用价值。以定量的HIV.1 DNA和RNA为标准外参照,利用SYBR Green荧光染料和GeneAmp5700 Sequence Detection System (5700系统).建立了删定HIV一1的前病毒载量和病毒 载量的荧光实时定量PCR技术。以病毒感染细胞和培养上清为材料.测定丁三种化台物(AzT。GL和wT)对细胞 内的前病毒载量和培养上清中的病毒载量的抑制活性,并与台胞体形成抑制方法测定化台物抗病毒活性的结果进 行了比较。根据病毒载量、前病毒载量和合胞体形成计算出的三种化台物的治疗指数均依次变小,提出以荧光实 时定量PCR技术测定前病毒载量.会在评价药物在体内外根睬或减少存在于CD4休止或记忆T淋巴细胞中的HIv 1前病毒方面有特别的价值。

汉坦病毒空气传播感染的实验室和野外采样研究

李劲松, 鹿建春, 车风翔, 盂令英, 刘敏霞

2001, 16(2): 124

本项研究是通过动物实验和现场采样研究救坦病毒气溶腔传播感染。用感染的黑线姬鼠排泄物自然形成的 病毒气溶腔进行实验。黑线姬鼠感染后第5天放入离TLd,鼠和乳小鼠.暴露10 d.检测不到抗体.感染后第7天,放 入离乳小鼠和乳小鼠.暴露10 d,可以捡测出抗体;黑线姬鼠在暴露15 d时,可以检测出抗体。可见黑线姬鼠感染 后.第7天可能是它向体外排毒的一个时问标志.且形成的病毒气溶腔具有感染性。对现场采集的空气样品和收 集的打答者佩戴的口罩样品的研究发现,在稻田堆放的稻捆根部和鼠栖息的草窝的空气中每350L空气中和打答 场脱粒机附近每96L空气中.古有至少一个具有生物活性的汉坦病毒粒子 结合流行病学调查结果,可 判定,汉 坦病毒经空气传播嗳入感染可能是秋冬季节肾综合征出血热发病的主要传播途径。

不同戊肝抗原检测抗-HEV IgM 反应性研究

戎广亚, 周继文, 雷厉, 赵桂兰, 孙杰

2001, 16(2): 128

目的 比较不同戊肝抗原检测抗一HEV lgM反应性。方法用HEV E30、E42、E33合成肺和HEV ORF-2重 组抗原建立酶免疫试验(EtA)检测肝病患者和健康人群中抗一HEV IgM。结果60份抗一HEV 阳性血清中.用E30、 E42、E33及重组抗原包被检测抗.HEVIgM.阳性率分别为76.6%,26 6%,18 3%.66.7%。用E30抗原进一步 检测戊肝急性期及恢复期血清,抗HEV IgM 阳性率为90%及3 3%。结论 HEV E30为抗原的EIA特异性强、 灵敏度高,是戊型肝炎早期诊断实用可靠的方法。

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

吕冬梅, 陈尔佳, 谢天宏, 庄俊英, 刘勇, 李春宏, 孙茂盛, 戴长柏

2001, 16(2): 131

利用PCR方法获得1163 bp的戊型肝炎(HepatitisEVirus.HEV)开放读码框架(0 nReadingFrame.ORF) ORF2之3’大片段和369bpORF3的完整片段.分别克隆到真棱表达载体pcDNA3中.构建两种含有HEV主要抗 原表位的质粒DNA:pcE2和poE3.分别或混合免疫Swiss小鼠三次(0时,第2周.第4局).观察其在小鼠体内诱发 的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEV IgG抗体.且在第 三次免疫接种两周后,100%的小鼠抗体阳转。与两种质粒单独免疫相比 两者同时注射的抗体水平较高 本研究 为HEV DNA疫苗的研究打下一定基础。

水痘一带状疱疹病毒地方分离株在兔脑神经细胞 中的形态与形态发生特征

宋艳艳, 王志玉, 王桂亭, 许洪芝

2001, 16(2): 135

为阐明水痘一带状疱疹病毒济南分离株(vzvJ.)在兔脑神经细胞(RNC)中的形态与形态发生特征,我们利 用超薄切片电子显微镜技术对感染VZvJ-的RNC进行了观察研究。结果表明:RNC在感染VZvj】6 h后核内可 见散在的核衣壳.12 h后细胞核和细胞质内核衣壳明显增多,24 h达高峰,而细胞核和细胞质内的成熟病毒颗粒较 少见。病毒大小、形态基本一致,呈圆形或椭圆形,核心直径30~50 nm.核衣壳74~96I~lTt,成熟病毒110~i80 tim 核衣壳内有3种类型的核心,即电子致密核心、部分致密核心和电子透明核心 细胞核和细胞质内均可见核 心样电子致密体和布纹样结构。在细胞质内还可见少量 繁殖复台体”.由膜性结构包绕多十囊泡构成。提示 VZvJj在RNC中的形态发生不同于其它性质的细胞。

汉坦病毒HTN261株s基因片段的 核苷酸序列测定及分析

孙成群, 陈露菲, 张宝山, 刘彦成, 崔岩, 吴玉华, 许君, 李冀宏, 刘忠伟, 孙蓉芳, 孔宪刚, 甄尚敏, 张秀彬

2001, 16(2): 140

黑龙江省是肾综合征出血热(HFRS)的重疫区。近年来HFRS年的发病人数曾超过万人。流行病学和血清 学研究表明黑龙江省HFRS疫区主要是姬鼠型,但目前尚缺乏病毒的分子生物学资料。我们对从瘦区捕获的宿主 动物,黑鲤姬鼠肺中分离的汉坦病毒HTN261株的S基因片段的全基因序列进行了测定和初步分析。结果如 r. HTN261株的S基因片段的全序列长为1697 nt 只有一个主要的编码N蛋白的ORF,起始位置为第37 nt,终止于1326 nt.编码的蛋白长为429 aa。没有发现存在ORlq:2。HTN261株的S基因片段核苷酸序列与HTN型中的病毒 株的劂源性很高.而与汉坦病毒其他型的同源性较差。从种系发生树分析来看.HTN261株归结于汉坦病毒的 HTN型;在HTN型之内.HTN261株和HTN76—11 8株在一个分枝内。就其核苷酸和蛋白的同源性来说. HTN261株和HTN76—118株的同源性分别是89%(全S基因)和98%(蛋白) 而与中国境内发现的其他汉坦病毒 株Z10,HId,Chert4.NC167等基因和蛋白的同源性相对较差=汉坦病毒除具有其宿主的依赖性外.还具有其地理 的簇集性。HTN261株和HTN76—118株之间S基因和N 蛋白序列的变异性的差异分别为11% 和2% .表明 HTN261株和HTN?6—118株还有不同,可能是不同的亚型。不过.尚有待于进一步研究证明。

棉铃虫核多角体病毒在中肠及其它组织中增殖过程的电镜观察

张严峻, 谭军, 林玉清

2001, 16(2): 151

应用电子显微镜技术观察了核多角体病毒在棉铃虫体内的增殖方式。在中肠细胞内增殖的核衣壳极少被囊 膜包围,也很少形成多角体 它们能大量地释放到体腔.迅速感染其他敏感组织。在其他敏感组织内增殖的核衣 壳大部分被囊膜包围形成病毒粒子.且随机包涵在多角体中形成核多角体。

替代宿主增殖松毛虫质型多角体病毒的比较研究

马永平, 孟小林, 胡蓉, 徐进平

2001, 16(2): 155

银纹夜蛾幼虫(Argyrogramma agnata)对松毛虫CPV(DpCPV)十分敏感,本文对两种不同的宿主增殖松毛 虫CPV作了比较.屯镜证实用替代宿主增殖的DpCPV与原毒株多角体(CPB)和病毒粒子的形态完全一致。3% PAGE分析二者的RNA图谱基本一致.有大小相同的2 98×10‘一0.66 X 10 道尔顿的10条带.用它增殖的 DpCPV(Aa-DpCPV)对松毛虫有相当的毒力.每头3龄幼虫病毒产量平均为2 5 X10 CPB。

杭州地区发生的玉米花叶病由甘蔗花叶病毒引起

程晔, 陈炯 一, 郑滔, 杨建平, 陈剑平

2001, 16(2): 170

从杭州地区呈现玉米矮花叶典型症状的玉米病组织中提纯得到大量线状病毒粒子 大多数长度为750 nm 病组织中含有大量风轮状内古体和板状集结体。病毒外壳蛋白为33 6 kD。病毒RNA1 3’端序列(1 8 kb)与甘蔗 花叶病毒(SCMV)同源性最高.达71 5%~99 1%,与高粱花叶病毒(srMv)同源性砍之,为67.8%~68 5%,与玉 米矮花叶病毒(MDMV)同源性最低.仅为38 4% ~48 4%.从而初步认为此病害由SCMV引起。根据已发表的 SCMV外壳蛋白氯基酸序列作亲缘性分析,表明SCMV可分为美国、南非、澳大利亚;德国和中国三大类。

口蹄疫病毒诱导宿主细胞凋亡的研究

吴海祥, 郑从义, 屈三甫, 郭荆哲, 王燕丽

2001, 16(2): 175

本文报道了口蹄疫病毒(F∞t—and-Mouth Disease Vh’us FMDV)在体外诱导PK.15细胞消亡的研究结果。采 用Hoechst33258荧光探针、DNA凝胶电泳、脱氧核搪核酸转移酶舟导的缺口末端标记(TUNEL)技术均检测到了 典型的细胞凋亡 结果显示:使用感染性滴度为4 8lgTCI /mL的口蹄疫病毒感染PK一15细胞,在培养32 h后r 荧光探针检测呈现典型的凋亡细胞核固缩和梅花状碎裂核,并伴随有凋亡小体出现,凋亡率约为20% ;DNA凝胶 电诛显示ladder梯带;末端标记检测到强绿色荧光标记物结合于凋亡细胞核上 研究结果提示:口蹄疫病毒可以 在体外诱导宿主细胞隅亡,细胞偶亡是其致细胞病交死亡的重要途径之一。

猴血中SFV病毒基因PCR检测方法的建立及应用

任丽虹, 白巍, 林凌, 孙明, 李华, 全文琦, 易红昆, 侯宗柳

2001, 16(2): 179

针对猴泡沫病毒SFV(Simian Foamy Viras)多聚酶区(pd区)设计两对引物,以猴血DNA为模顿进行嵌套式 PCR扩增 得到500 bp左右基因片段,克隆进入pUC一19载体,经测序鉴定为SFV 465 bp的po】区基因片段 将此 段序列与SFV各型425 bp的p 区基因片段进行阿源性比较,它与SFV-1型的同源性最高,为92.O0%。在此基础 上,用这两对引物对158例猴血DNA进行检测,阳性54例,阳性率为34 2%。发现在猴群中有较高的SFV病毒 的感染。

伪狂犬病病毒Ea株EP0基因的克隆序列分析 及其在大肠杆菌中的表达

方六荣, 陈涣春, 肖少波, 马相如, 王革飞

2001, 16(2): 183

曲狂犬病病毒Ea株(PRV-Ea)细胞感染物为模板,PCR扩增出1.23 kb的EPO基因完整编码区片段.将该 基因片段克隆到pBluescriptⅡsk+中并构建三个测序质粒,双脱氧末端终止法序列测定并同国外InFh株进行同源 比较,发现PRV-EaEP0基因存在多处点突变和一处缺失突变,但无插^突变和移码。进一步将该片段插入到原核 表达载体pET一28a的His—Tag下游,掏建的原棱表达质粒pETEP0在大肠杆菌Bk】(DE3)中获得了高敛表达,sDs PAGE结果显示,表达的蛋白分子量为62 kD,并形成包橱体。Western印迹分析表明,该蛋白带能与Ea株野毒高 免血清发生特异性反应.证实PRV-Ea EP0基固在B l(D )中获得了正确表达,并且具有免疫学活性。为今后探 ^研究该基因的功能奠定了基础。
Brief Reports

丙型肝炎患者血浆和外周血单个核细胞 同步检测HCV.RNA和HGV-RNA

李淑莉, 曾令兰, 罗端德, 刘薇, 郭劲松, 杨小铭

2001, 16(2): 188

To understand the incidence of hepatitis C and hepatitis G cointection,and positive rate of HCV RNA or HGV—RNA in plasida and PBMC.HCV—RNA and HGV—RNA in phsma and in periph— eral blood mononuclear ceILs(PBMC)of the 40 patients were amplified with R r-PCR.There were 6 an d 8 HGV—RNA positive cases in plasma and PBM C.respectively.And there were 5 HGV—RNA po s— itive cam both in plasma an d PBM C At the same time.there were 5,6,3 both HCV—RNA and HGV— RNA positive cases in plasma.in PBMC and in both plasma and PBMC.respectively.It accounted for 13% ,15% and 8% .rasp~tivdy.The HCV—RNA and HGV—RNA positive incidence of PBM C Was higher than that of plasma The incidence of HCV—RNA and HGV.RNA coinfection was similar to European,American and Japanese.The synchronous detection has an important signficanee in avoid— ing leaked diagnosis

HCV NS5A基因表达及其在血清学检测中的应用评估

阮华, 部金荣, 叶林柏, 徐进平, 王晓玲, 赵月娥, 吴正辉

2001, 16(2): 190

Full-length NS5A gene of the hepatitis C virus was amplified by PCR using plasmid pBAC25 containing HCV nonstructural gene as template.The am plified fragment(about 1.34 kb)was cloned into plaS d pQE32.and the recombinant plasmid pQENSSA was expressed in JM109 strain The NS5A protein WaS purified by NiS04 metal chelating resin,and characterized by W estern—blot Its antigenecity was de~ermined by ELISA The positive detection rate of anti—NS5A was 75% (69/92) in ninety—two clinic sera The positive rate of anti—NS5A was 82.5% (33/40)in fourty positive stan— dand sera,and the negative rate of anti—NS5A was 10O% (40/40)in fourty negative standand sera The results showed that the Full—length NSSA proteinn had the higher sensitivity and specificity in the detection of HCV antibody in sera,we suggested that NS5A protein was a useful antigen for blood screening.