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2001年16卷3期

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Contents

植物病毒协生作用及其分子机理

鲁瑞芳, 李为民, 彭学贤

2001, 16(3): 195

植物病毒协生作用分布广,是造成农作物减产的重要原因之一 抗病毒转基因植物中协生作用的出现,严重 限制了基因工程植物的商品化生产。本文对植物病毒协生作用的类型和特点、协生作用中病毒与病毒、病毒与环 境问的相互作用盈其分子机制进行了阐述。
Research Article

我国SEO型汉坦病毒全S基因核苷酸序列测定

耿志洲, 高爱武, 杨彦改, 王华, 郭彦敏, 安洪明, 杭长寿, 陈宇萍

2001, 16(3): 202

为获得SEO型病毒基因组更为详尽的资料,也为局部暴发的原因提供科学的资料,我们采用病毒分离、McA1)s 分型.RT-PCR扩增及核苷酸序列测定的方法,在国内首次测出我国SEO型病毒较为完整的垒S片段,并与76.118、 Seoul、SRII株的核苷酸及氨基酸同源性进行比较.分别为:64.2%、91.8% 、96.8%及80 5%、95 4%、97.3%。表明病 毒基因组间的重排不是造成发病高峰的原因。

PCR微孔板杂交法检测不同人群TTV DNA

郭乃洲, 王万相

2001, 16(3): 208

根据报道的Trv全序列设计引物和探针,建立眦’微孔板杂交法,检测81例正常人群、92例职业献血员123 例甲一庚型肝炎、32例非甲一庚型肝炎、48例原发性肝癌患者的TⅣ DNA。结果表明Trv在以上五种人群中的阳 性卓分别为3 7%、4.3%、21.1%、28.1%、52.O%,前者与后三者比较有显著性差异(P0.O5),Trv台并HBV二重 感染占重叠感染的54.0%。这揭示不同人群均存在Trv感染.正常人群和职业献血员存在健康携带状态,甲一庚 型肝炎和非甲一庚肝炎病人为高危人群,Trv可与各型肝炎存在重叠感染,Trv除经血传播外.存在其它传播途径. Tnt感染与ALT及TBⅢ 的升高密切相关。

甲肝病毒在猴胚肾细胞和Vero细胞上的分离与适应

井中荣, 姜述德, 余芬, 王燕

2001, 16(3): 212

使用恒河猴胚肾(加强)细胞从临床标本中分离和适应了甲肝病毒w和X,通过阻断实验、中和实验、免疫荧 光和免疫电镜实验、RT-PCR对其进行特异性鉴定,证明是甲肝病毒。w株和x株第7代在MEK细胞上的抗原滴度 分别为1:512、1:1024,感染滴度(1ogTCIDxJmL)分别为8.17、8.50。只有分离株w可以适应于 细胞,第6代21d 抗原滴度为1:256,感染滴度( I蜘 /rnL)为8.o0。

丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探

冷彦, 陈秀珠, 杜勇, 毛春生, 杜桂鑫, 王海涛

2001, 16(3): 215

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录一巢式PcR从1份Hcv慢性携带者的阳性 血清及1份丙肝患者的血清中获得HCV NS2全长eDNA,将其克隆于T载体,各随机挑取5个阳性克隆进行序列测 定。结果显示克隆到HCV.NS2全长基因,所测克隆在核苷酸水平和氪基酸水平互不相同。该慢性携带者HCV NS2 区序列以完整读码框架(0RF)为主,一个于HCV多聚蛋白第8 位氪基酸的位置出现终止信号,而该丙型肝炎患者 以NS2 N端发现终止信号的序列为主,其中三个于第835位氪基酸的位置出现终止信号,一个于第887位氪基酸的 位置出现终止信号,仅一个克隆的序列为完整ORF。对ORF竞整的序列进行比较,发现丙型肝炎患者氮基酸变异主要集中于N端,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似。研究表明从我们选择 的两倒感染者的HCV 盟序列看,不同临床类型的Hcv病人体内的HCV准种在N啦区存在差异,这种差异可能与 病毒存在于机体的状态有一定的一致性。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

成军, 施双双, 钟彦伟, 夏小兵, 王刚, 王琳, 刘妍, 陈菊梅

2001, 16(3): 220

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白卫的人源单链可变区抗体(scFv)的原核表达 载体,并在太肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-E2一scFv。以重组的HCV E2蛋白为包被抗原,利用噬苗体抗体库 的表面展示技术,筛选到含有HCV-E2-ScFv基因的噬苗体克隆.从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经^lm 】/ £I 酶切鉴定后,该SeFv基因由750bp组成,将其亚克隆到~ ITAB5E载体中,转化太肠杆菌.UMI~,提取质粒进行 DNA序列测定,符合ScFv的基因结构特点。IPIG诱导转化的大脑杆苗JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV 单链可变区抗体的表达。酶联免疫吸附法(ⅡJsA)证实表达的HCV-E2一ScFv具有与重组HCV E2蛋白的反应活 性和特异性,对转化的J/vll09大脑杆菌上清中表述的HCV.E2-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),证实表达的 HCV-E2-sc 的分子量为28kn。为应用HCV.E2.ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了 基础。

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

王淼, 杜广希, 金勇丰, 张耀洲

2001, 16(3): 224

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原阳性血清中提取病毒DNA ,采取PCR技术扩增出前表面抗原 (preS)基因片段 ,重组到质粒载体上 ,对该基因进行了全序列测定 [GenBank索取号CpreS HZ :AF 32 5 6 74;preS LZ :AF 32 5 6 75 ]。克隆的HBVpreS基因杭州分离物 (preS HZ)和兰州分离物 (preS LZ)全长 5 2 2个核苷酸 ,编码174个氨基酸。preS HZ与已发表的HBVadr亚型上海分离物[8] 、北京分离物[9] 、日本分离物[5] 、HBVadw亚型[10 ] 和ayw亚型[11] preS基因的核苷酸序列同源性分别为 96 .7%、96 .2 %、97.3%、88.7%和 84.1% ,氨基酸序列同源性分别为 96 .0 %、94.9%、97.1%、85 .1%和 85 .4% ;preS LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为 96 .4%、96 .2 %、96 .9%、88.7%、83 .7% ,氨基酸序列同源性分别为 94.9%、94.9%、96 .0 %、85 .1%、84.1%。分子进化分析 (DNASTAR ,1999)表明 ,克隆的两例HBVpreS基因属于adr亚型。preS LZ与preS HZ之间有两个核苷酸变异 (对应两个氨基酸变异 ) ,相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点。在免疫保护区内二者具有较好的保守性 ,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗。

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒组织蛋白酶基因的 序列分析和进化研究

刘岚 陈新文 孙修炼 Hilary Lauzon Just M. Vlak Basil M. Arif 胡志红

2001, 16(3): 229

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (HaSNPV)的组织蛋白酶 ( cath)基因进行了序列分析 ,此基因编码区长 10 98bp ,预计编码一个 36 6个氨基酸的蛋白产物。序列分析表明 ,HaSNPV的V CATH蛋白与其它杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构并保留有相同的酶活性位点 ,根据已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建了 cath基因的进化树 ,发现HaSNPV的 cath位于NPV组中一个单独的分枝 ,结合 cath基因在棉铃虫病毒基因组中的位置与其它NPV有较大不同 ,推测HaSNPV的 cath基因可能拥有特殊的进化历程。

斜纹夜蛾核多角体病毒DNA XbaI 4.0 kb片段锌 指蛋白基因及重复序列分析

胡国栋, 王立华, 胡晓辉, 杨凯, 庞义

2001, 16(3): 236

测定了斜纹夜蛾棱多角体病毒(辛, q litura nueleopolyhedm~4ms,spk~v) 山大学分离株基因组DNA Xba I 4 0 kb片段全序列.该片段包括一个锌指蛋白基因及三个区域的DNA重复序列(SR1、SR2、SR3)。该锌指蛋白基因 读码框为2196个核苷酸,编码731个氨基酸的蛋白质,分子量为83.09kD,该蛋白的等电点为4.61。在其5 非编码 区内有一个杆状病毒早期启动子基序GAGT及一个TATA盒,在其终止密码的下游有5个真核生物转录mRNA时 polv(A)加尾信号AATA从。在223~241氨基酸残基之间有一个锌指蛋白基序,这一基序属于锌指蛋白基序中的 C3HC4类,即环指(彤 丘n )类基序。在323~340氯基酸残基区域为一个核定位信号。该蛋白可能为一个高度折 叠的蛋白质。在该片段中存在三个DNA重复序列区域(sm、SR2、SR5).其中SRI与SR3区域存在更大量的重复序 列.SR1区域其中的一个重复序列长达41bp,SR1、SR3重复序列区域可能作为该病毒转录的增强子.或者作为DNA 复制的起始点。

棉铃虫核型多角体病毒p40基因序列分析

武家才, 张传溪

2001, 16(3): 242

克隆了棉铃虫(He//an~rpa帅面 %)单粒包埋型核型多角体病毒(n iPv)基因组胁 m.H、J片段,其长度分 别为10 kb和6 7kb。通过对克隆片段末端测序,得到HaSNPV p40基因全序列。p40基因编码区全长966bp,预计可 编码36.kn的多肽。n iPv p40基因核苷酸序列与flzSNIW p40基因有98%的相同性。这两种基因与BmNP p40 (&ⅡBa|lk—L331~0)和Ael~IPV~41(C,enBank—L22858)的氨基酸序列相似性43%左右,但四种蛋白对应于H~NPV p4o、HaSNPV v4o的28 277氨基酸区域,同源性高达62%,并且存在一个保守的亲水性结构域。进一步将在基因 组中相邻的胁tdⅢ 一H、J两片段用BamH I、 RI、Hind m、Psti四种限制性内切酶进行了分析。

浙江和河北发生的一种水稻、小麦、玉米矮缩病是水稻 黑条矮缩病毒引起的

张恒木, 雷娟利, 陈剑平, 吕永平, 陈声祥, 薛庆中。, M.J.Adams

2001, 16(3): 246

以浙江省的水稻黑条矮缩病和河北省的玉米粗缩病的病毒分离物为材料.对我国南北方两种病毒分离物进 行了比较研究。两种病毒分离物的粒子大小形态相似,且在血清学上密切相关;二者的介体、寄主相同,并引起相 同的症状。提纯两种病毒分离物的基因组片段凝胶电泳显示它们相应的基因组片段之间大小极其相似: 根据水 稻黑条矮缩病毒(ttiee black streaked dwarf virus),RBSDV的研和s8设计引物,利用RT-PC~技术,在两种病毒分离物 中均可特异扩增到预期太小的片段。序列测定比较分析表明:它们的同源性达97.0% 一98 9%,与日本R.BS’DV的 同源性(92 2% 95.5%)高于与意太利MRDV的同源性(76.6% ~88 4%)。从而认为我国南方的水稻黑条矮缩病 和北方和玉米粗缩病都是同一种病毒——RBsDv引起的,也就是说我国北方的玉米粗缩病病原实际上是水稻黑条 矮缩病毒,而不是玉米粗缩病毒。

黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV—Xb)RNA3 eDNA的克隆和序列分析

王海河, 谢联辉, 林奇英

2001, 16(3): 252

通过lIT-PeR方法,设计两对引物,克隆了黄瓜花叶病毒香蕉株系(C~,f~-Xb)ITN_43,并进行了棱苷酸和蛋白质 水平上的分析。结果表明xb株系I1NA3全长2205nt,具有两个蛋白编码阅读框架(O~dr).其中5’端(97—936nt)编码 一个279粕的3a蛋白;3’端(1225—1871nt)编码一个218aa的CP蛋白。5’非编码区域为96Il【;基因间隔区(IR)长 288nt;3’NR含有324nt。通过与亚组Ⅱ其它株系RNA3棱苷酸和所编码产物推导的氨基酸序列分析发现,亚组Ⅱ株 系无论在编码区还是非编码区的核苷酸同源性都相对较高;亚组Ⅱ株系在进化过程中具有连续性。

A亚群禽白血病病毒囊膜基因gp85片段在大肠杆菌中的表达

刘公平, 赵振芬, 刘福安

2001, 16(3): 257

将RAV-I囊膜基因 gp85片段亚克隆到表达质粒pET-21d(+)中得到重组表达质粒pET-21d-RAV-1 ca-tv( / sd.q,序列分析表明该插入片段的核苷酸序列和阅读框都与RAV.1囊膜基因相应序列相同。用其转化大肠杆菌 BL21(DE3)并经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明RAV一1囊膜基因融合蛋白表达产物约20如,与理论值相符;IPTG诱导起始时间比诱导持续时间对表达量的影响更大。

L6565小鼠白血病病毒诱发小鼠白血病

李永念, 杨占秋, 刘建军, 郭广松, 肖红, 文莉

2001, 16(3): 261

为探讨病毒与白血病发生的关系,我们用Ih565小鼠白血病病毒(IJ5565 MLv)悬液感染乳鼠,每周观察小鼠的 发病情况及病理变化,并用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)动态检测小鼠体内病毒核酸的分布。结果发现:小鼠 感染病毒后3—5周,其脾脏和淋巴结呈早期白血病的病理改变。至第l0一l2周小鼠发生淋巴细胞白血病.表现出 耸毛、活动减少、腹膨胀等症状。病毒核酸于感染后第2周首先在小鼠胸腺、脾脏检测到,随时间延长,病毒核酸广 泛分布在外周血、胸腺、脾脏、淋巴结等多种脏器组织中。本实验表明I~565小鼠白血病病毒可诱发小鼠白血病,其 机制可能与病毒促使淋巴细胞向白血病细胞转化有关。

运用套式PCR检测传染性喉气管炎病毒核酸

黄庚明, 辛朝安

2001, 16(3): 265

选择鸡传染性喉气管炎病毒保守TK基因的蛋白编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并 优化了检测鸡传染性喉气管炎病毒DNA的套式PCR法。通过检测IⅡv感染的鸡胚绒毛尿囊膜、实验室病料和临 床病料,结果表明,套式PCR法能检测出ILTV感染后的非免疫鸡胚和SPF鸡胚绒毛尿囊膜研磨液中的被稀释了 105倍的病毒(约1 的Ⅱ v DNA),攻毒后第10天还能从非免疫鸡和SPF鸡气管拭子中检出Imv,第1O天非免疫 鸡气管拭子中Ⅱ爪,的最大检出率为7/10,第10天SPF鸡气管拭子中IⅢ 的最大检出率为8/10。对非免疫鸡和 SFF鸡的气管拭子中IⅡv最佳检出时间均在攻毒后第5天。对临床样品中的IⅡv的最大检出率为7/7。经过核 酸杂交验证,套式pcR法具有很高的特异性和敏感性.为从分子水平探讨Ⅱ v的发病机理、临床早期快速诊断提 供了新的研究手段

特异寡聚核苷酸对猪瘟病毒在细胞中增殖抑制作用的研究

周鹏程, 聂玉春, 曹圻, 陈建国, 丁明孝

2001, 16(3): 270

本实验探讨了寡聚核苷酸对CSFV复制的影响以及作为抗CSFV新型药物的可行性。实验结果表明针对cs— n_5’端非编码区NS3蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚棱苷酸对CSIW 复制均有显著的抑制作用,而针对CSIW 3 端非编码区寡聚核苷酸仅有轻微抑制作用,5 端寡聚棱苷酸具有最佳抑制作用,同时发现相应序列中正义聚核苷酸 的作用要优于反义寡聚核苷酸;脂质体介导转染能显著提高寡聚棱苷酸对csFv复制的抑制作用。这些初步结果 也提示,CSF’q 5’端和3’端非编码区对CSF’q复制的重要性和作用有所不同。

含四个串联核酶和GFP基因的转基因质粒的构建

邹键, 沈学仁, 吴建华, 周国瑛, 龚祖埙

2001, 16(3): 275

以含绿色荧光蛋白(crP)基因的质粒pSK100-DS、含切害j对虾杆状病毒基因的核酶P,zl的质粒pRG Rzl、含核 酶Rz2的质粒pRG Rr2和转基因空质粒peDNA3为基础.把绿色荧光蛋白GFP基因克隆于[,eDNA3的SV40启动了 下面,由SV40启动子控制:含四个两种核酸基因的四联体克隆于pd~A3的多克隆位点区,由T7启动子控制.构建 成含两个Rzl、两个Rr2和GFP基因的转基因质粒pGTR,以用于转基因抗病毒对虾的研究。

丙型肝炎病毒CS,NS3 NS4区抗原融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

李铭, 沈小川, 林矫矫, 倪振亚, 苑纯秀, 刘金明, 杨冠珍, 蔡幼民, 吴祥甫

2001, 16(3): 283

丙型肝炎病毒是与输血有关的非甲非乙肝病毒山;是全世界输血后获得性肝炎的重要病因之一。并与急慢性肝炎、肝硬化和肝癌有关。由于主要通过输血的传播,会给人民的身体健康尤其输血事业带来极大危害。采用基因工程技术,表达含有多段抗原的融合蛋白作为HCV检测试剂的抗原,可以简化多种抗原的表达及纯化过程,并提高了试剂的均一性 2。研表明,在HCV的抗原基因中,核心蛋白Core、NS3区的C33e抗原、NS4区基因编码的抗原免疫原性最强,相应抗体出现早,分布广,亲和力强。因此,我们构建了含有中国人HCV序列的Core、C33c及NS4抗原的融合基因,并在太肠杆菌中表达了融合蛋自。该融合蛋白具有庭好的抗原性,有望发展成为新型HCV酶联免疫诊断试剂盒。

蜀柏毒蛾核型多角体病毒基因文库的构建及几丁质酶基因的定位

赵小东, 周建华, 丁清泉

2001, 16(3): 286

蜀柏毒蛾(Parocner/a。 咖Chao)是柏木、桧 柏、干头柏等柏科树种的重要食叶害虫¨l J,到目前为 止仅存在于我国。蜀柏毒蛾核型多角体病毒 (Parocner/a orienta nuclear polyhedrovims,PaorNPV)[ ] 于1991年被分离,该病毒对蜀柏毒蛾幼虫具有较强 毒力,已作为一种新型的生物农药初步应用于柏木 林区害虫的防治上¨3 J。对这种病毒已进行了一些研 究,包括生物活性测定,形态结构,理化特性,限制性 内切酶分析_4J一。为了进一步研究其分子生物学特 性,开发我国这种特有的病毒资源,我们构建了部分 Pao’rNPV基因组DNA片段的基因文库,同时以中国 棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(HearSN?V)几丁质 酶基因作探针,对PaorNPV几丁质酶基因进行了定 位,结果报道如下。