For best viewing of the website please use Mozilla Firefox or Google Chrome.

2002年17卷1期

|     

Contents

HSV一2阴道感染并诱导小鼠阴道粘膜上皮细胞凋亡

陈保平, 陈道平, 林雨霖, 周峰, 张尉英。, 刘军, 陈敏诲

2002, 17(1): 1

抽要:最近的报道指出,某些病毒有诱导体外细胞 亡的作用,借以限制病毒的扩散。为探讨HSV.2在体内诱导细胞谰亡的救果及其形态学特点,用HSV-2 333株感染小鼠明道,于感染后不同天数处死动物.取其阴道,固定于10%中性福尔马林,TUNEL末端标记染色显示 亡的细胞,光镜下进行原位观察。结果显示:感染后的第l天粘膜上皮内即出现大量的凋亡细胞,第2天至ll天j弼亡细胞的数量及在上皮内的分布范围达最高水平。早期的拥亡细胞见于感染后所有标本,其核染色质形态及分布似正常细胞 但它被TUNEL标记染成橡黄色:晚期的谰亡细胞亦见于所有标车 其胞棱缩小,染色质浓缩并在核周边集聚,核中心空化。载有拥亡细胞的上皮在阴道牯膜上分布很广,最广的可占全明道上皮的2/3。同时可见HSV一2引起的上皮细胞坏死及疱疹形成,二者均由凋亡细胞包围。 亡细咆不断地由上皮表面脱落至酮遭.未见凋亡小体及眷噬现象。结果提示,HSV 2 333幛阴遭感染可同时诱导细胞坏死及谰亡,细胞捌亡可能在限制病毒产生子代及限{l;I感染区域扩展起重要作用。 Abstract:Recently 8ome reports have shown that some viruses could induce apoptosis of infected cells in uitro to limit their spread.To clarify the effect of HSV-2 strain 333 on induction of apoptosis and its morphological characters in vaginal epithelia the mice were infected with the virus intravagina lly,an d killed at the intervals between day 1-11 post infection(P.I.).The vaginas weTe taken and fixed in 10% neutral formalin for paraffinembeding section and TUNEL staining to demonstrate apoptosis. The results were as follows.Numerous apoptotic cells appeared in the epithelia on the first day of in— fection .the number of the apoptotic cells reached to a high level on day 2—11 P.I..At early stage of apoptosis,the cell nuclei displayed norma1.but their chrornatin were stained by TUNEL staining. W hen the chromatin condensed and migrated to the periphery.then left a blank space in the center of the nuc .The apoptotic area spread widely.occupying 1/4·2/4 of the vaginal epithelia At the S;~L,’TLe time,the necrotic areas and herpetic vesicles in the epithelia could be found to restrict only in Solve areas not as widely as the apoptotic areas and were surrounded by the apoptotic areas The apoptotic cells fell off into the vaginal hanen without form ing apoptotic bodies an d phagocyosis.The results showed that the HSV一2 strain 333 could induce apoptosis and necrosis of vaginal mucosal epithelia at the 8an~e time in mice.The apoptos~ might play an impomant role in limiting both the range of viral spreading an dthe production of progenyvirus

中国人HIV辅助受体CXCR4基因的克隆及序列测定

范兆军, 李敬云, 罗保君, 李天宪

2002, 17(1): 6

摘要:为了获得HIv辅助受俸CXCR4基因,进一步探索艾滋扁(AlD6)的诊断、防治方法,采用逆转录巢式聚合酶 链式反应(RT-nPCR)从中国人外周血淋巴细胞中克隆了CXCR4 cDNA基因.得到了预期的1 100bp左右的片段。 将PCR产物与T载俸连接.并进行了酶切反应鉴定,获得与T载俸正向连接的克隆。测序结果表明:克隆的片段 古有一十开放性阅读框架.编码352个氨基酸残基。搜索GenBank.目标片段与M99293、XM051223、XM051224、 XM051225有很高的同源性,比较结果显示:克隆的片段包括完整的编码序列.舍两十碱基的差异。
Research Article

丙型肝炎病毒E2基因DNA免疫实验动物研究

刘源洁, 叶林柏, 徐进平, 部金荣, 冯磊, 孙明颢, 李江, 吴正辉

2002, 17(1): 11

抽要:将编码丙型肝炎病毒(Hcv)E2蛋白417-750位氨基酸的DNA片段克隆到真核表达载体r~-DNA 3.1(一) 中的CMVIE启动子下游,掏建成HCVE2重组真棱表达质粒pcE2。EL1SA法检测pcE2DNA免疫兔血清中的融 抗体变化和维持规律,结果显示免疫20d已有抗体产生,30d后开始进入高峰,40d时达到最高值,至第90d抗体水 平保持平德,抗体滴度达到L:1600左右。流式细胞计数仪(FACS)检测pcE2DNA免疫鼠CIM 、c瑚 T淋巴细胞 变化情况.与注射空载体pCDNA3.1(一)的阴性鼠相比.cD4 淋巴细胞水平略有上升.CD8 细胞水平有较大升 高.增幅达35.46%。免疫组化检测结果显示注射poE2的小鼠组织中有明显的阳性着色.而注射口cDNA3 1(一)的 殖照组小鼠免疫组化结果为阴性 以上结果表明:pcE2在宴验动物内表达出的HCVE2蛋白可以引起免疫动物的 体液免疫应答和细胞免疫应答,尤其是MHC-1限制性杀伤性CD8 T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利 的,因此HCV E2 DNA免疫有可能成为预防和治疗HCV感染的一条新途径。

乙型肝炎病毒X基因准种特点的研究

董菁, 施双双, 皇甫竞坤, 成军, 王勤环, 李莉, 斯崇文

2002, 17(1): 22

以乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的异质性表现来探讨HBV准种在 慢性感染者中的存在状态。以中国株HBV基因序列为依据,设计特异性多聚酶链反应引物, 自9例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV X基因,克隆入pGEM Teasy质粒,随机挑选克隆进行D NA测序以确定病毒的变异程度。37例测序结果提示来源于不同患者HBV X基因序列高度保守 ,但每个序列均不一致。X区除了存在广泛的碱基点替换突变外,序列的缺失突变占测序克 隆总数的51.4%(19/37);氨基酸缺失及移框突变多发生于123位氨基酸残基之后,可导致X蛋 白多种羧基端形式。结果提示HBV长期携带者体内有HBV准种共存,X区内存在热点缺失突变区,该区突变结果可能影响X蛋白反式激活功能。

湖北省不同地区汉坦病毒M片段的分析研究

候炜, 杨占秋, 曲虹, 赵呈, 肖红, 蔡惠兰

2002, 17(1): 26

参考汉坦病毒(Hv)的基因文库软件设计M 片段G1区型特异性引物, I-IV 76/118、H一114、A9及R2 株 RNA为阳性模板,建立HV的分型方法——逆转录一半巢式聚合酶链匣应(RT-heminested PCR),对湖北省不同地 区分离的30株HV进行分型。结果显示:(1)建立的RT-heminested PCR分型方法对I-IV两型的代表株76/118 (HTN)、A9(HTN)、H一114(HTN)及 2(sE0)RNA进行丁特异性扩增,其大小与理论值一致;此法只能检测HV RNA,不能检测其它病毒RNA。(2)分离于湖北省不同地区的30株Hv的分型结果为汉滩型21株、授城型9株, 其中长江 南汉滩型12株、汉城型2株;长江以北汉濉型9株、汉城型7株。这表明建立的RT—heminested PCR用 于HV的检测特异性好;分析湖北省不同地区分离的30株HV,显示湖北省HFRS流行为混合疫区;且在湖北地区 具有一定的地理聚集性。

丙型肝炎病毒多表位抗原在恒河猴中的免疫应答及保护性试验

和绍清, 杨芳, 代解杰, 胡方, 黄建生, 李琦涵

2002, 17(1): 30

利用HCV抗原多表位来研制HCV疫苗是目前的一个新方向。本研 究利用HCV的HCV的5个保守表位串联,并加入破伤风类毒素上的一个T细胞激活位点,设计成 一个HCV多表位抗原基因PCX,在大肠杆菌中表达,用此蛋白免疫恒河猴,诱导猴体产生了较 高的抗体水平,滴度达1∶1000以上,在免疫后的60周抗体滴度仍达1∶40以上。同时,在免 疫后6周用人HCV阳性血清攻击猴子,免疫PCX的猴子出现一过性ALT升高,在攻击后三周内用 RT-PCR检测到猴血清内HCV的RNA阳性。结果表明,免疫多表位的PCX蛋白可以诱导机体产生 高水平的免疫应答。 It is a new approach to study and produce HCV vaccine by using multi-epitope antigen of HCV. In this study, multi-epitope antigen gene, PCX, which consists of 5 epitopes of HCV and an epitope of T cell stimulation o f tetanus toxoid, was expressed in E.coli. And rhesus monkeys were vaccinate d by expressed antigen and elicited the high humoral response, the titer of anti bodies to PCX was high to 1∶1000. In 60th week after vaccination, the titer of Abs was still to 1∶40. Meanwhile, positive human sera of HCV challenged vaccina ted monkeys after 6 weeks immunized, ALT value rose transiently in monkeys vacci nated by PCX. It was positive in monitoring RNA of HCV using RT-PCR in monkey s era. The result demonstrated that Rhesus monkey immunized by multi-epitope PCX could elicit high-level immune responses.

育龄妇女和母婴巨细胞病毒感染的流行病学调查

严银芳, 陈晓, 杨小清, 况二胜, 祝兵, 董长垣

2002, 17(1): 34

摘要:我I『1应用ELISA技术和PCR技术对武汉市地区1051名育龄妇女和195对母婴的巨细胞病毒感染进行了血 清流行病学调查。结果表明 1246名受检妇女CMVIgM和IgG抗体阳性率分别为3.6%和82.2%。195对母婴 有20名产妇尿中CMV-DNA阳性,所生子女中有3名尿中CMV-DNA阳性,相关率为L5%。受检妇女中98名有 不良孕产史.其CMV IgM和IgG抗体阳性率与无不良孕产史妇女比较均有显著性差异(p0.01)。

人类轮状病毒基因DNA免疫的初步研究

彭世勇, 王健伟, 温乐英, 何金生, 洪涛

2002, 17(1): 38

:本文研究人类轮状病毒基因DNA免疫及应用。通过构建重组质粒pCI/x~7.pCl/x-p4及pCI/vp6,以肌注法 导入BALB/c小鼠肌肉组织.其中pCI/vp7及pCl/x-p4能有救引起机体免疫应答,而且对轮状病毒wa株有一定中 和效应。从车次试验的结果来看,人类轮状病毒DNA疫苗能作为预防病毒性4,JL腹泻的一种手段。

汉滩病毒s基因及其5’端真核表达载体的构建及 在细胞中的表达

潘蕾, 白雪帆, 黄长形, 李光玉, 陈红梅, 韦三华, 杨为松

2002, 17(1): 47

摘要:体外研究设濉病毒(HTNV)S基因及其5’端表达的意义,为核蛋自T细胞表位的研究奠定基础。设计2套 引物.用PCR方法从PBV220一$22原核质粒中扩增出s基因全读码框(37—1326bp)及s基因5’端(37—501bp).用TA 克隆将其克隆A pcDNA3 l/V5一His~TOPO载体中.成功构建peDNA3 1-S及pcDNA3 1-S-N真核表达载体,并通过 脂质体转染至Vem细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到pcDNA3 1-S及pcDNA3.1-S-N在Vero细 胞中的表达。pcDNA3 1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体有较高的转染效率.目的基因能在宿主细胞中表达.有 利于研究HTNV—S基因在T细胞表位研究中的意义

腹腔注射重组腺病毒诱导的免疫反应

吴娟, 李嘉琦, 孙茂盛, 戴长柏

2002, 17(1): 51

摘要:为研究重组腺病毒接种实验动物后的免疫反应性,利用RT-PCR方法.从HAV的RNA中克隆了结构蛋白 基因插入穿梭质粒pXCXzNot I,通过磷酸钙一DNA共沉淀技术,将复制映陷型腺扁毒载体与线形化的pXCX2一CMVHAV 共转染293细胞。一系列检测方法证明产生了重组腺病毒rAdHAV。纯化后的rAdHAV滴度为1× 10 TCIDso/mL,腹腔注射免疫昆明种小白鼠后,可诱导产生抗HAV IgG和HAV中和抗体。复翻缺陷型腺病毒可 作为发展基因王程病毒疫苗载体的有效系统

抗T0RcH.IgM 型抗体临床对比检测研究

况二胜, 杨复华, 何祥旺, 刘剑雄, 严银芳

2002, 17(1): 56

摘要:TORCH系列病原微生物(包括弓形虫Tox、风疹病毒RuV、巨细胞病毒CMV、单纯疱疹病毒HSV I/Ⅱ等) 是一组具有致畸作用的病原俸 孕妇感染可导致流产、早产、畸形甚至死眙 目前TORCH IgM型抗体的检误I都在 不同程度上受到非特异性的干扰,采用有效方法消除干扰对TORCH IgM型抗体检测的准确性至关重要 为此我 们对比了多种消除IEM检测中非特异性干扰的方法.并以最佳方法对256倒女性献血者、143倒正常妊娠和61例 异常妊娠标本进行ToRCH IgM抗体的对比检测。结果显示健康人群中TORCH活动性感染率较高,健康孕妇 TORCHIgM 的总阳性率高达23 1%(其中Tox5 6%、CMV9 8%、RuV8 4%、HSV4 9%);而异常妊娠则显著上升 (p0 01).其中Tox、CMV、RuVIgM 阳性率上升明显(P0 05),分别为l9 7%、26 2%、24 6%。由此可见孕期 TORCH病原微生物活动感染是致异常妊娠的主要因素之一.应严密监视孕期TORCH病原檄生物活动性感染,特 别是弓形虫、风疹病毒和巨细胞病毒的感染。

丙型肝炎病毒NS5A基因在昆虫细胞中的表达及其分布研究

冯磊, 叶林柏, 阮华, 郜金荣, 徐进平, 刘源洁, 吴正辉

2002, 17(1): 60

应用PCR方法从古有丙肝病毒全部非结掏蛋白基因的质粒pBAC25中扩增出全长的NSSA基因DNA片段 (约1 34kb).PCR扩增NSSA基因片段克隆到转移载体pBlueBacHisA中。重组转移质粒pBlueBacHL~5ADNA与野 生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染SF 9昆虫细胞.通过空斑纯化获得带有NSSA基因的重组病AcNSSA。对重 组病毒基因组DNA进行酶切和PCR鉴定,证宴HCV NSSA基因已插入重组病毒基因组中。AcNSSA感染SF.9细 胞后.在细胞中表达出一条64kD的蛋白,用Westert1.hint分析.结果表明这种蛋白与抗HCV HS5A特异性抗体发 生强烈反应.说明NSSA基因已在细胞中得到表选、应用免疫荧光技术与免疫组化技术进一步研究NS5A蛋白在昆 虫细胞中不同时间的表达情况及其分布,结果表明,NSSA蛋白在AcNSSA重组病毒感染细胞24h后主要分布在细 胞质膜上,而在48h后则同时分布于细胞质瞳和细胞核内.在72h则完全布满整个细胞.我f『]认为NSSA蛋白定位 于质膜和细晦核中.暗示着在病毒复制过程中NS5A蛋白可能参与病毒RNA在质膜上复制和细胞基因表达的调 控。

斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定

尹崇, 余健秀, 庞义, 胡晓晖, 李朝飞, 王立华

2002, 17(1): 66

摘要:蔗糖密度梯虔离心法提纯斟纹夜蛾核多角体病毒(SpedopterⅡlit“m muhinudeocapsid nucl,mpolyhdrovinas. SphMNPV)包埋型病毒粒子(polyhedna-derived vir PDV),以此病毒粒子作抗原.免疫家兔获得抗血清;用SDS裂 解缓冲渣提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白。采用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA),利用抗PVD抗血清对 病毒受体进行检测,结果表明斜纹夜蛾中肠细咆总蛋白中40kD、73kD、85kD的三种蛋白能够结台PDV。

T_4病毒科一个新成员的分离鉴定

胡远扬 欧阳国杰 张珈敏 李莉 邬开朗 易福明 尹宜农

2002, 17(1): 73

从松毛虫中分离一种球状二十面体病毒粒子。病毒直径为44nm 。通过低温冷冻电镜技术和计算机图像处理技术,研究了该病毒衣壳的三维结构。结果表明 ,病毒颗粒具双层结构,衣壳由240个亚基组成,分布于T=4的二十面体上。病毒核酸地衣酚 反应呈阳性,联苯胺反应呈阴性结果。而紫外吸收实验则呈明显的单链特征,辅以酶消化实 验的结果,证实该病毒为单链RNA病毒。琼脂糖电泳显示该病毒RNA分子大小约为5.2kb。SDS-聚丙烯酰胺电泳表明该病毒结构蛋白有一条大小约为52kD主带和一条弱带(39kD)。本病毒 是T-4病毒科的一名新成员,这是我国首次报告的T-4病毒科的病毒。

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

应松成, 郑从义, 屈三甫, 张楚瑜, 王在时

2002, 17(1): 77

摘要:采用猪瘟病毒野毒珠(CSFV39)感染猪肾传代细胞系PK一15,经连续传79代,建立了稳定的病毒持续感染细 胞模型.获得CSFV39一PK15细胞株。用免疫荧光、RT-PCR检测、透射电镜跟踪观察了CSFV39一PK15细胞株连续 传代中病毒在细胞内的存在情况。结果表明第9,29,79代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特 征。这为课八研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础。

不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析

范泉水, 夏成柱, 邱薇, 黄耕, 何洪彬, 余春, 乔军, 武银莲, 殷震

2002, 17(1): 82

摘要;根据已发表的CAV纤突基因序列,用PCR方法,对4个CAV 2毒株和4十CAV一1毒株的纤突基因进行了 扩增和测序,测定的核甘酸序列经推导得到分别编码543和542个氨基酸 C’AV纤突蛋白垒序列。测定的CAV. 2比较表明:我国流行的CAV.2 SY强毒株与国外标准强毒株Tomnt0 A26/61株相同.其驯化致弱的毒株与驯化前 相比在1134位发生碱基颇换。测定的CAV 1比较表明:我国流行的CAV-1株与标准强毒RI26l株差异相对较 大,而国内cAv_l毒株互相之间相对差别较小 CAV.2与CAV,1纤突基因的同源性为80.48%。

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

芦银华, 陈德胜, 华修国, 黄伟坚, 谈国蕾, 陈溥言

2002, 17(1): 87

摘要:根据GertSank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对弓I物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统 消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组筝i病料中扩增出ORF2全基因(702hp)。将此片段克隆入pGEM.T easy载体,筛 选获得重组质粒pTORF2,井对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2 分离株AF264039的核苷酸及氮基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV 2毒株同源性分别为92.3% ~98.6% 和92.3%~% .6%。重组质粒pTORF2经BarnHl、EcoR V双酶切,回收ORFE基因,转移入真核表达载体pSec— Ta /HygmB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2。此重组表达载悼的构建成功为进一步研究 ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盘打下基础。

桃蚜体内与病毒结合的共生菌Buchnera groEL基因的克隆和序列分析

崔晓峰 吴云锋 林林 梁小波 张建新 周广和

2002, 17(1): 69

以桃蚜(Myzus persicae)杨凌生物型为材料,利用一对特 异性引物 ,用PCR的方法从桃蚜体内扩增出了内共生菌的Buchnera groEL基因,序 列 测定结果表明其长度为1 647bp,与GenBank中的桃蚜荷兰生物型、蜿豆蚜(Acyrthosiphon  pisum)日本生物型Buchnera GroEL基因长度相同,同源性分别为99%和91%;Buchnera GroEL-YL编码548个氨基酸,序列比较发现与Buchnera GroEL-NT仅有3个氨基酸的差异,即AA111MetLys、AA222ValMet and AA348GlnHis.
Brief Reports

对虾白斑病毒1197基因的表达和产物纯化的研究

应智伟, 周国瑛, 龚祖埙

2002, 17(1): 92

1993年以来,我国沿海省份相继发生养殖对虾 大批死亡现象,损失严重,引起国内外研究者的重 视。经过一段时间的努力研究后,我们报导了引起 该病的病原是一种无包含体的杆形病毒⋯ 。此后, 该病毒的一些其他特性及引起对虾的病理学及组织 学的变化又陆续见诸于报导_2, 。前文中我们报导 了该病毒的一个早晚期基因1197的克隆和序列分 析,并针对此基因设计了二个核酶,在体外成功地对 此基因进行了切割_4 J。本文报导我们对该基因进 行了原棱表达,并对表达产物进行了纯化的研究, 期为阐明该基因表达产物的功能打下进一步研究的 基础。