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2002年17卷3期

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Research Article

汉坦病毒基因组G1区部分酶切位点的研究

熊莉娟, 罗端德, 曾令兰, 蔡淑清

2002, 17(3): 195

用分型RT—PCR方法对34份武汉地区肾综合征出血热患者外周血标本扩增,扩增的目的片段为汉坦病毒 M 片段G1基因部分序列,应用Hin C 1I和Sac I两种限制性内切酶消化扩增产物,可将汉坦病毒区分为HTN型和 SEO型.结果与分型PCR有很高的一致性,并可迅速筛查在Hinc 1I和Sac I酶切位点有基因变异的变异株。

登革2型病毒E蛋白在酵母菌中的分泌表达

魏惠永, 江丽芳, 薛耀华, 郭辉玉

2002, 17(3): 198

以pPICZ a B为载体,应用RT—PCR从感染D2V的C6/36病变细胞中克隆全长E基因,电转化法将重组质 粒整合入巴斯德毕赤氏酵母菌,经抗生素筛选、表型鉴定和PCR分析得到Mut 型的多拷贝整合菌,经甲醇诱导培 养可产生69kD的融合蛋白,与含组氨酸尾的D2V包膜糖蛋白分子量理论值相符;免疫印迹证实该表达产物可与 D2V E特异性单抗和D2V 多抗进行反应;表达产物经金属螯合亲和层析可获得纯化的含组氨酸尾的E融合蛋白 并保留其免疫反应性。研究显示克隆的全长D2V E基因可在毕赤氏酵母菌中高效分泌表达,E融合蛋白最大表达 量0.1g/L。

应用噬菌体随机肽库技术筛选丙肝病毒NS3抗原模拟表位

钟彦伟, 成 军, 陈新华, 王 刚, 洪 源, 王琳, 李 莉, 张玲霞, 陈菊梅

2002, 17(3): 202

以抗.HCV NS3的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附一洗脱一扩 增”的筛选过程,随机挑取42个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性 结合实验,最后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV NS3抗原的模拟表位。经噬菌体富集后,从随机筛选 的42个克隆中得到11个阳性克隆,确定氨基酸序列xxIxxxXMSNxx为HCV NS3的模拟表位。我们用噬菌体 l2肽库成功筛选得到HCV NS3的模拟表位,为开展用HCV 模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。

乙型脑炎病毒减毒中间株SA14—12—1—7基因组全序列的测定

曾 明, 俞永新, 董关木, 范行良, 姚智慧, 李德富

2002, 17(3): 206

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA 12—1.7株进行全序列测定和分析,进一步了解乙脑活疫 苗减毒及其稳定性的分子机制。根据已发表的SA 14.2株及SAl4株的序列,设计6对重叠引物,涵括整个乙脑病 毒的基因组,通过RT—PCR扩增出SA 12.1.7株的各cDNA片段,分别克隆到pGEM.T载体,转化至TG1受体菌 中,挑取阳性克隆进行鉴定后测序。结果表明SA 12—1.7株基因组全序列长10976个核苷酸,从96到10394为一 个长开放读码框,编码3432个氨基酸。与野毒株SAl4和疫苗株SA 14—2的核苷酸序列和氨基酸序列相比,同源 性均在99% 以上,突变位点分散于各个区域,E区有5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同,3个位点与野毒株一 致而与疫苗株不同,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关。此外,NS3、NS5和3 NTR的几个位点可能与病 毒毒力稳定性相关。综上所述,乙脑病毒减毒中间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列,若干突变位点影 响病毒的弱毒性及毒力的稳定性。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义。

不同地区HPV16 E7基因的克隆及序列差异分析

熊金虎, 伍欣星, 谭 云

2002, 17(3): 211

采用PCR扩增、pGEM—T载体克隆和核苷酸序列分析的方法对一例武汉地区及两例五峰县高发区宫颈癌患 者体内HPV16型的E7基因编码区进行序列分析并与野生型(德国标准株)及已发表的HPV16湖北株(HPVHB) 进行了比较。结果发现武汉地区HDV16型E7基因仅第54位出现一个同义突变,而高发区HPV16型E7基因存 在差异,第77位氨基酸由精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys),第96位由谷氨酰氨酸(Gln)变为精氨酸(Arg),E7蛋白 的二级结构及亲、疏水性也相应改变,与野生型有较大差异。

乙型脑炎病毒野毒株及其不同株减毒株E蛋白基因序NLI:较

范行良, 俞永新, 李德富, 姚智慧

2002, 17(3): 216

为了解乙脑减毒活疫苗株SA14—14—2的神经毒力减毒机制,用RT—PCR方法分别扩增不同减毒程度毒株的E 基因,克隆、测序,继而对各毒株序列进行比较。结果表明SA14强毒株与SA 12—1—7株间只有3个氨基酸发生改 变(E-107,E一176,E一439),SA l2一l一7与SA14—9—7和SA14—5—3株间有另3个氨基酸发生改变(E一138,E一279,E一315)。 SA 9—7株与SA】4—5—3株只有一个核苷酸NT一405不同,但未引起氨基酸改变。SAl4—14—2疫苗株除保留SA14—12— 1—7和SA 9—7所改变的6个氨基酸外,另有2个氨基酸发生了改变(E一177,E一264),共计在E区共发生8个氨基 酸的替代。SA 12—1—7株的低神经毒力很不稳定而其余各株的弱毒特征很稳定。因此,E-176(I1e— Va1),E-439 (Lys一 g)和E一107(Leu--~Phe)可能与神经外和神经内毒力减弱有关。E一138(Gu1一Lys),E一315(AJa— Va1)和E一 279(Lys— Met)的突变可能与神经毒力的减弱和稳定性相关。

汉滩病毒西安分离株84FLi的L片段核苷酸序列测定以及分析

李新红, 杨为松, 杭长寿, 白雪帆, 马本江, 黄长形, 李光玉

2002, 17(3): 221

采用逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR),分节段扩增汉滩病毒84FLi株的L基因片段eDNA。纯化的PCR产 物片段直接用于序列测定或克隆入pND18一T载体中进行测序。结果表明。84FLi株的L片段eDNA 由6533个核 苷酸组成,四种核苷酸的比例分别为A33.39% ,C16.43% 。G20.74%,T29.44% 。GC 含量为37.17%。AT 含量为 62.83% 。推导出的最大开放读码框架为从38到6493,共编码2151个氨基酸。序列同源性分析表明,84FLi株核 苷酸与HTN型国际标准毒株76—118的同源性为83.7%,差异性为18.8%;而与中国株A9的同源性高达97.6%。 差异性仅为2.4% 。与SEO型代表Seou180—39的同源性为75.2% 。66.1% ~66.5% 。L片段的氨基酸比较分析表 明,L片段与HTN型问的同源性为97.5% ~98.0% ,而与SEO型的同源性为83.5% ~85.5% 。与PUC、TUL、SN 和AND等其它型汉滩病毒的同源性仅为68.6% ~69.6%。结果表明84FLi株属于HTN型,并与分离自国内的 HTN型病毒高度同源。

汉滩病毒M、s基因不同拼接方式在昆虫细胞中融合表达效果比较

罗 雯, 徐志凯, 张芳琳, 阎 岩, 吴兴安, 刘 勇, 白文涛, 王海涛

2002, 17(3): 226

将汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)部分片段以不同方式拼接,构建G1SO.7或SO.7G1嵌合基因,分 别插入杆状病毒表达载体pFBD。转化DH10Bac致敏菌。获得含有嵌合基因的重组穿梭质粒Bacmid,用其转染Sf9 细胞.快速筛选出含有G1SO 7或SO.7G1嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达外源融合蛋白。利用间接 免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果表明,含G1SO .7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞 中表达出融合蛋白,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别,其分子量约97kD;含SO.7G1 嵌合基因之重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的融合蛋白,只能被抗汉滩病毒核蛋白特异性单抗所识别,其分子量 约43kD。上述结果提示.G1SO.7嵌合基因可能在昆虫细胞中表达出完整的具有生物学活性的融合蛋白,SO.7G1 嵌和基因的昆虫细胞表达产物不完整,且生物学活性不如G1SO .7嵌合基因的表达产物。

腺病毒EIB 55kD癌蛋白与hDaxx的相互作用

万艳平, 吴移谋, 谭立志, 廖端芳

2002, 17(3): 230

为了探讨腺病毒(adenovirus,Ad)E1B 55kD癌蛋白(Ad E1B 55kD)打破hDaxx和PML共定位细胞核的作用 机制,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究Ad EIB 55kD与hDaxx的结合反应,并通过酵母双杂交体系测定两种 蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列。结果显示:Ad2 EIB 55kD 通过C端58个氨基酸(aa)与hDaxx结 合并发生相互作用。Adl2 EIB 55kD与hDaxx结合需全序列aa及其构象。共免疫沉淀反应和Western blot结果证 实Ad2/5或Adl2 EIB 55kD能在体内外与hDaxx直接结合。

棉铃虫核多角体病毒z 一3基因的序列分析

张小霞, 粱振普, 牛国栋, 张忠信料, 丁清泉

2002, 17(3): 234 doi: 1003—5125(2002)03—0234—05

在棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera Single-nucleocapsid Nucleapolyhedrovirus,HaSNPV)基因组中发 现了 .3基因,该基因位于病毒基因组的BarnHI F片段上,全长1140bp,编码379个氨基酸,预计蛋白质分子量 为44kD.启动子区具有TATAbox,位于起始密码子ATG上游40~43nt处,在终止密码子下游具典型的poly(A)终 止信号AATAAA。并且在它的氨基酸序列的 一端也具有一个类似SSB保守序列的基元结构。

WHS3菌株产几丁质酶对棉铃虫HaSNPV的增效作用

徐红革, 彭辉银, 刘家欣, 白志强, 谢 薇

2002, 17(3): 239

WHS3(Serratia marcescens)菌是一株几丁质酶的高产菌株,在诱导培养基中几丁质酶的产量可达 84.4 g/mL。通过对中国棉铃虫进行的生物测定表明:WHS3菌所产的几丁质酶(A3)能有效地提高HaSNPV的毒 力20% ~70% ,LTs0、LT90比对照组缩短天数最高可达1.1d、1.3d。

黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒在双抗转基因线辣椒内的增殖

徐秉良, 商鸿生

2002, 17(3): 243

本试验以转化CMV—CP和TMv—CP基因的转基因线辣椒纯合系植株作为研究试材,比较了单独或混合接种 CMV和TMV后,转化线辣椒的抗病性表达特点,并测定了两种病毒在植株体内的病毒含量。结果表明:转化线辣 椒不仅能抵抗CMV和TMv 的单独侵染,而且还能抵抗CMV 和TMv的复合侵染。转化线辣椒表现为系统症状 延迟出现7—15d,显症株率和病害严重度级别大幅度降低,CMV和TMv在接种叶、新生叶中的病毒含量明显减低。 转基因线辣椒原生质体作为研究试材接种CMV,测定病毒含量结果表明:CMV 病毒的增殖在转基因线辣椒原生 质体内受到明显抑制。在CMV 接种浓度为40t~g/mL,感染原生质体48h后,CP(一)植株原生质体内CMV是CP (+)的4.2倍。这一结果揭示了转基因线辣椒具有抑制病毒增殖的抗病性。

马铃薯s病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

吴兴泉, 吴祖建, 谢联辉料, 林奇英

2002, 17(3): 248

依据马铃薯S病毒(Potato virusS,PVS)外壳蛋白(CP)基因序列(885bp)设计合成了两对引物,通过RT—PCR 扩增得到长0.8kb的目的片段,将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子,测定序列 结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较,发现其核苷酸同源性达95% 左右;构建了含PVS CP基因的融合蛋 白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定融合蛋白的分子量为58kD。

鸡传染性法氏囊病上海超强毒株NH99的分离与鉴定

孙建和, 陆 苹料, 李 晖, 赵 渝

2002, 17(3): 252

通过对上海近郊某鸡场数群10日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检 测及病毒核酸纯化、VP2基因序列的测定与分析,确认上海地区以发病日龄早,发病率、死亡率高为特征的鸡传染 病为超强毒型鸡传染性法氏囊病,病原具有鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvlBDV)的分子特征,为vvlBDV。

蛙病毒核糖核酸酶Ⅲ基因结构及其序列分析

吕 玲, 何建国料, 何华虹, 邓 敏, 翁少萍, 王晓红

2002, 17(3): 257

对蛙病毒(TFv)核糖核酸酶Ⅲ基因序列进行分析。TFv 基因组中含有完整的核糖核酸酶Ⅲ 基因序列,全长 为1 ll3bp,GC含量为56.63%。其推定蛋白质的分子量为40.47kD,等电点为7.99。序列结构分析发现在编码区 的下游有可形成茎环的反向重复序列和形成发夹结构的回文序列。与其它物种相比,TFv与虹彩病毒的LCDV.1 和CIV的核糖核酸酶Ⅲ基因的氨基酸序列同源性较高,与酵母、线虫等物种的相应基因的同源性较低。

中华绒螯蟹二株呼肠孤病毒的初步研究

张叔勇, 张建红, 黄灿华, 石正丽

2002, 17(3): 263

在研究中华绒螯蟹病害的过程中,分离到两株呼肠孤病毒(分别命名为EsRV816和EsRV905)。EsRV816 从江苏某养殖场分离,EsRV905从武汉某养殖场分离。EsRV816和EsRV905的病毒粒子为球状对称结构,大小 分别为65nm和55nm。病毒粒子基因组分别为10和12个节段的双链RNA。根据它们的宿主范围、基因组节段数 及电泳型。这两种病毒很可能属于呼肠孤病毒科的两个新属。
Brief Reports

IBV广东分离株GD05 S1基因的克隆、鉴定及其表达

黄亚东, 王林川, 李校垄, 黄自然

2002, 17(3): 266

Acording tO Avian Infectious Brochitis virus(IBV)Beaudette strain S 1 gene sequence,a pair of primers were designed and synthesized.W ith the primers, IBV Guangdong isolation strain GD05 S 1 gene was successively amplified by RT — PCR .PCR product was digested w ith BstY I,Hae III and Pst I respectively,the result showed RFLP pattern of was the same as that of M41 S 1 gene. IBV GD05 strain was thought as M ass serotype primaryly.IBV GD05 S 1 gene was cloned into pGEM — T vector and sequenced, its sequence was consisted of 1611 base pairs.By comparison , the nu— cleotide sequence was 97.14% identical tO that of IBV M 41. IBV GD05 S 1 gene was subcloned into expression vector pET21 d.SDS—PAGE experiment showed that it expresed in E .coli.
Review

昆虫杆状病毒若干基因的研究进展

洪靖君, 段家龙, 彭辉银

2002, 17(3): 270

昆虫杆状病毒(Insect baculo irus)对鳞翅目、双 翅目和膜翅目等昆虫具有病原性,是一种开发应用 较广、高效的生物杀虫剂,具有杀虫专一、效果好、有 流行传播作用等优点。为了更好地利用昆虫杆状病 毒为防治农林害虫服务,加快昆虫杆状病毒杀虫剂 研究的步伐,本文归纳了近几年来有关昆虫杆状病 毒基因研究进展供从事研究的人员参考。

树驹应用于病毒学方面的研究进展

胡溪柳, 李际强

2002, 17(3): 276

树匡鞫(Tupaia)是一种在生物医学研究中很有应 用价值的新型实验动物,其分类尚有争议,有人认为 是食虫类,有人则将之列为低等灵长类,还有人认为 树鳓是一个独立目的,称为攀鼢目(Scandentia)⋯ , 但目前基本定为低等灵长类。由于其具有体积小, 类似松鼠,比较容易饲养和操作,管理方便,繁殖力 高,廉价经济等优点,树鼢存在多种自发性疾病,对 多种病毒易感,而且其进化程度高,新陈陈谢和大体 解剖与人较为接近,因此其作为较理想的实验动物, 已经被广泛地应用于医学与生物学的研究中。在病 毒学方面,树匡鞫不但被用作疱诊病毒、腺病毒、EB病 毒、甲型和乙型肝炎病毒、轮状病毒的研究L2 J,而且 还用于流感病毒、丙型和丁型肝炎病毒、基孔肯雅病 毒等研究。本文仅就树匡鞫在病毒学方面的应用概况 作一介绍。

水生甲壳类动物病毒研究动态.I.杆形病毒

石正丽, 祝海燕

2002, 17(3): 279

水生甲壳类动物病毒的研究始于一种地中海螃 蟹(Portunus depurator或Liocarcinus depurator)体 内发现的类呼肠孤病毒⋯ 。随后,人们相继在这类 动物体内发现多种病毒,其中约17种为杆形病毒。 这些杆形病毒的多数往往只是被它们的宿主携带 (尤其是螃蟹和淡水甲壳类动物)而不引发疾病,其 研究仅限于组织病理和形态的描述。而在对虾体内 发现的杆形病毒却对对虾养殖业造成巨大的经济损 失,成为研究的热点。其中,有两种形成核多角体的 对虾病毒在感染部位、形态和血清学特征等方面非 常接近杆状病毒科的核多角体病毒属,被称为对虾 杆状病毒。其它不形成核多角体的杆形病毒没有确 定的分类地位。为了避免概念上的混淆,本综述将 所有不形成核多角体或核包埋体的 J、具有杆状形 态的病毒通称为杆形病毒。对形成核多角体或核包 埋体的、具有杆状形态的病毒称为杆状病毒。本文 将着重介绍水生甲壳类动物体内发现的杆状病毒和 杆形病毒的动态研究。表1列出了在水生甲壳类动 物体内发现的杆形病毒的基本特性。

柯萨奇病毒B3基因组及其变异与心肌损伤的关系

李相军, 任立群, 李广生

2002, 17(3): 286

肠道病毒感染是人类急性和慢性心肌炎的常见 病因之一,而且也与人类扩张型心肌病(DCM)的发 生发展有密切关系⋯ 。病毒分离,血清学研究,免 疫组化技术、原位核酸杂交技术以及聚合酶链反应 技术(PCR)均提示肠道病毒与心肌炎关系密切。最 近,LI等[ ]用肠道病毒特异性单克隆抗体,采用改 良的免疫组化技术对心肌炎或DCM 病人心肌切片 中肠道病毒抗原进行检测,此法直接证明了心肌炎 或DCM 病人体内确实有子代病毒产生。但是,肠 道病毒究竟通过怎样的机制引起心肌损伤还未阐 明,推测可能有多种机制参与。本文仅就肠道病毒 (柯萨奇病毒B3,CVB3)基因组结构及其基因变异 与心肌损伤的关系方面加以综述。

病毒对细胞凋亡的影响及作用机理

张小霞, 张忠信

2002, 17(3): 289

自Kerr等1972年提出细胞凋亡(apoptosis)概 念以来,这一生物学现象的研究已受到广泛重视,细 胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自 身程序进行自杀的过程。但它与程序化细胞死亡 (PCD)不是同一现象⋯1。程序化细胞死亡具有严格 的基因时控性,一定时间内使某些细胞死亡而让另 外一些细胞新生,其调控是非常精确的。细胞凋亡 虽也涉及基因调控,但它只是瞬时发生的形态学变 化过程,它以细胞皱缩。胞浆致密,染色质浓缩成大 小不等的块状,DNA 梯级性降解,细胞膜内陷形成 多个凋亡小体等生化和形态学变化为其特征。