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2002年17卷4期

Contents

登革病毒基因组核苷酸序列与血清学分型的相关性研究

宋 宏, 付士红, 王寰宇, 梁国栋

2002, 17(4): 297

为证明登革病毒基因组核苷酸序列与病毒血清学分型的相关性,本文以病毒全基因组和病毒5 末端非编码 区.E蛋白.NS1蛋白和3 末端非编码区四个基因区段分别进行病毒型间比较。比较结果表明病毒全基因组和病 毒的各个基因区段均明显分为相互独立的4个分支,与病毒血清型分型完全吻合,不存在型间重组的现象。文章 进一步分析了各型登革病毒型内核酸序列的相似性和型内病毒重组的可能性。
Research Article

重组人乳头瘤病毒核酸疫苗诱导特异性淋巴细胞增殖

伍欣星

2002, 17(4): 304

采用分子克隆技术,将人乳头瘤病毒16型E7(HPV 16 E7)基因重组于真核表达载体上,构建了HPV 16 E7 核酸疫苗。将该疫苗通过皮内注射方式免疫BNb/c纯系小鼠。基因免疫后制备小鼠脾淋巴细胞悬液,经体外E7 蛋白再次刺激后用M1vr比色法检测出了特异性淋巴细胞增殖反应。由于特异性淋巴细胞增殖是反映细胞免疫功 能的简便有效方法,所以本实验表明HPV 16 E7核酸疫苗构建正确,并能够诱导机体产生特异性细胞免疫应答。

利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

栾 怡, 于修平, 宋长芹, 卞继峰, 赵蔚明, 贾继辉, 周亚滨, 齐 眉

2002, 17(4): 308

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1一VLP两种抗原在检测宫颈癌 抗16 L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长 1535bp的HPV16L1基因片段,克隆至pUC18一T载体中,进行DNA测序鉴定。然后,将HPV16L1基因克隆至 pGEX-2T表达载体中,并诱导表达HPV16L1融合蛋白,分子量为83kD,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经 GST柱层析法纯化后,与重组腺病毒表达的HPV16L1一VLP分别经酶联免疫吸附(ELISA)法检测12份宫颈癌患者 和35份献血员血清。12例宫颈癌血清标本中,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为7例(占58.3%);抗HPV16L1一 VLP的抗体阳性率为8例(占66.7%)。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG(+)的7 份患者血清。利用HPV16L1一VLP试剂盒检测均阳性;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG(一)的5份患者血清,利用HPV16L1.VLP试剂盒检测有1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异(P0.05)。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1一VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16 L1对宫颈癌的抗体进行定性、定量分析有助于该疾病的诊断。

HBV PreS2+S/IFN.I】【融合基因真核表达载体的构建及其表达

陈红梅, 白雪帆, 潘 蕾, 李光玉, 韦三华, 黄长形

2002, 17(4): 312

构建含HBVPrdS2+S和IFN—a融合基因的真核表达载体pcDNA3.1.S2s/IFN.a并在真核细胞中进行表达。 应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/IFN 回 收后直接克隆到pcDNA3.1 V5/His TOPO TA克隆载体,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2s/IFN—a。然后用脂质 体法转染vem E6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定,证明连接正确;经间接免疫荧光检测证实该 重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2s/IFN—a的成功 构建及在vem E6细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据。

湖北地区2001年度流感疫情分析

詹发先, 潘南胜, 叶国军, 陈思礼, 龚镇奎, 刘传楠, 朱洪浩

2002, 17(4): 315

通过流感病毒分离、人群流感抗体水平测定和流行病学调查对2001年度(2001年3月至2002年3月)湖北 地区流感疫情进行了分析。结果表明:本年度湖北武汉地区出现过两次流感季节性小流行.第一次在2001年8~9 月,主要由甲1型流感病毒引起;第二次在2001年12月至2002年1月,以甲3型流感病毒占优势。从病毒分离鉴 定和抗体水平测定的情况分析,这次流行的甲3型流感病毒与1999年分离的毒株相比,可能发生了抗原性漂移。

一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

王汉中, 司艳红, 方明刚, 陈新文, 胡志红

2002, 17(4): 319

将含有低拷贝数的mini—F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZa基因8.6kb的DNA片段经同源重组 置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制 形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid—HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10 启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多 角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFaStBacPhP10供体质粒。利用HapFaStBacPhP10供体质粒将eGFP基因转 位至HZ8的Tn7附着位点上,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmid DNA转染至HZAml细胞内。转染5d后, 细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的 HaBac to Bcac表达系统能有效的表达外源基因。

TnGV增强蛋白在AcMNPV中的表达和活性分析

李志广, 尹 隽, 钟 江

2002, 17(4): 326

为了研究杆状病毒增强蛋白的活性基团,本文构建了分别表达三种N端部分缺失的粉纹夜蛾颗粒体病毒增 强蛋白的重组杆状病毒,这三种蛋白在N端分别缺失了150,186和250个氨基酸。用重组病毒感染Tn一5B1.4细 胞.成功地表达了这三种蛋白,并得到了纯化的蛋白质。通过体外降解围食膜的方法检测这些部分缺失的增强蛋 白的活性,结果证实这三种蛋白均失去了增强蛋白的降解围食膜粘蛋白的活性。这一结果表明,增强蛋白的N端 对其降解围食膜粘蛋白的功能是必需的。

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒几丁质酶基因的克隆与表达

吴 东, 王华林, 邓 菲, 陈新文, 彭辉银, 胡志红

2002, 17(4): 331

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)几丁质酶基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点.利用 PCR扩增出不含N末端信号肽以及C末端内质网定位肽的几丁质酶基因片段。将该基因片断克隆至原核表达载 体pProEXHTb,经IPTG诱导,在大肠杆菌DH5a中获得了高效表达,表达产物的大小为60kD,含量占菌体总蛋白 量的4O%。利用来源于AcMNPV几丁质酶的抗体对表达蛋白进行检测,获得特异性的显色信号,证实所获原核表 达产物与杆状病毒的几丁质酶具有同源性。

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA 基因

梁 钧, 龚 岷, 袁志明, 梁布锋

2002, 17(4): 336

幽门螺杆菌cag A 基因克隆到杆状病毒表达系统的pBlueBacHis2A转移载体中,将重组质粒pBlueBacHis2A。 CagA与亲本病毒Bac.N.blue DNA共转染Sf9细胞,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒。经PCR法鉴定后进行扩 增培养,SDS-PAGE和Western bolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白,间接ELISA分析表明。表达产物可与 Hp感染者血清发生特异性的免疫反应。

重组人白介素一12在银纹夜蛾中的表达纯化及其生物活性

徐进平, 孟小林, 王 健, 鲁 伟

2002, 17(4): 340

KB细胞经PDBu刺激,采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。RT—PCR法获得重组人白介素一12(rhlL一12) P35和P40 cDNA。将hlL一12 P35 cDNA和P40 cDNA分别克隆到pAcUW51载体的Polyhedrin和P10启动子下 游,构建pAcUW51一IL12转移载体。pAcUW51一ILl2与坏死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA 共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac—hiLl2。该病毒经血腔感染银纹夜蛾幼虫.采用亲和层析法纯化rhlL一12; SDsPAGE(银染法)、Western blot鉴定表达和纯化的产物;ELISA检测rhlL一12含量;MTT法检测rhlL一12样品生 物活性。rhlL。12分子量为75kD。rhlL一12在Sf9细胞培养中表达水平为17.8 g/10 细胞;在银纹夜蛾幼虫中表达 水平为200—300mg/L血淋巴。纯化的重组rhlL-12样品对经PHA—P激活的PBMC有明显的增殖活性.且具有明 显的促NK细胞杀伤活性的生物活性。

大麦黄花叶病毒属成员UTR系统进化树分析及编码蛋白跨膜结构推测

陈 炯, 陈剑平

2002, 17(4): 344

对大麦黄花叶病毒属成员的同源性和系统进化树分析表明,同一病毒RNA1和2基因组5’-UTR区域在进化 上的相关性高于不同病毒同一RNA组分间的关系,而3’-UTR则相反。蛋白质二级结构分析显示RNA1编码的 P3和14K 蛋白存在跨膜结构。BaMMV 6 1分离物P3蛋白跨膜结构在大肠杆菌中原核表达时有致死作用。类 比P0tyviridae科其它属成员功能,此2个蛋白可能与膜附着功能相关。RNA2编码的P2蛋白存在两个结构保守的 跨膜区域,一些摩擦接种保存的大麦和性花叶病毒(BaMMV)分离物和燕麦花叶病毒(OMV)P2蛋白此两个结构 (或一个)缺失后,不能由介体禾谷多粘菌(P.graminis)传播,揭示P2蛋白跨膜结构与禾谷多粘菌传播能力相关。

榆黄蘑中一种抗病毒蛋白的纯化及其抗TMV和HBV的活性

付鸣佳, 吴祖建, 林奇英, 谢联辉

2002, 17(4): 350

采用阴离子交换层析和凝胶层析方法从新鲜食用菌榆黄蘑(Plearotus citrinopileatus)中进行了抗病毒蛋白的 纯化.结果获得了一个纯化蛋白YP46—46,经SDS-PAGE可确定其分子量为27.41d3。以半叶法在枯斑寄主心叶烟 上检测该蛋白对烟草花叶病毒(TMV)的抑制率,发现有较好的抗TMV活性,其抑制TMV的中浓度为0.24~g/ rnL。同时以HeDG2.2.2.15细胞株为模型,对所获得的蛋白进行体外抗乙型肝炎病毒效果的评价。结果表明该蛋 白对HBsAg的50%抑制时的浓度为0.08 g/mL,但对HBeAg效果不大。

BIV在人源细胞MT一4中的活性研究

王书晖, 杨怡姝, 朱义鑫, 夏秋雨, 陈国敏, 王金忠, 陈启民, 耿运琪

2002, 17(4): 354

牛免疫缺陷病毒(Bovine imm“” ciency virus,BIV)在分类上属于反转录病毒科的慢病毒属,目前尚未见 BIV感染人的报道。为进一步确定BIV对人源细胞的感染性,我们用BIVl27cDNA转染人源细胞MT一4,通过RT— PCR检测到BlVgag基因的转录,IFA则显示BIVl27的gag或gag-pol基因在MT一4细胞中得到了翻译,而RT值的 测定也有力地说明BIVl27(-DNA已经在MT一4细胞内表达出有活性的反转录酶,但细胞传代实验表明BIV不能在 MT一4细胞内复制。

一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因

孙建和, 蒋 静, 陆 苹, 赵 渝

2002, 17(4): 358

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(wlBDV)上海株SH95的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将 RNA反转录成eDNA,以此为模板一步扩增出A片段前体融合蛋白基因即vP2—4—3基因,将其克隆入pGEM.T载 体.并进行序列分析,其与超强毒株HK46的核苷酸序列的同源性达98%,整个基因有5个氨基酸差异,同源性达 99.51%(1007/1012)。

蓝舌病毒HbC株与不同种系细胞相互作用及群特异性抗原特征

唐省三, 董长垣, 郭淑芳, 陈 晓, 陈冬娥, 桂亦瑞, 芦莉莉, 罗 翔

2002, 17(4): 362

:BTV.HbC株和蓝舌病毒标准株BTV一10分别接种在不同种系细胞如猴肾传代细胞(Vero)、人宫颈癌细胞 (Hela)和小鼠神经胶质瘤细胞(C6)等细胞株上,比较研究了BTV.HbC在不同种系细胞上的增殖特征,BTV.HbC与 BTV.10在相同细胞上的复制增殖特征,病毒与细胞相互作用的显微和超微结构特征。用免疫交叉反应研究了 BTv—HbC株与BTV.10型标准株之间的血清学关系。本研究结合本室对BTv.HbC株基因组图谱分析和蓝舌病毒 群特异性抗原编码基因 的RT.PCR分析,进一步证实了BTV—HbC株可能是一个新的血清型蓝舌病毒。

测定λ原噬菌体诱导频率的新方法

范成鹏, 方呈祥, 张珞珍, 戴淑香

2002, 17(4): 367

本文报道两种测定 原噬菌体紫外诱导频率的新方法一菌落计数法和平板诱导法。将溶源菌液经紫外诱 导暗培养稀释后直接涂布在平板上培养,根据平板上菌落形成单位数计算 噬菌体紫外诱导频率。另一种是将溶 源菌与指示菌混合制备的平板用紫外线诱导,根据平板上噬菌体形成单位确定 噬菌体紫外诱导频率。这两种方 法不仅能准确测定噬菌体紫外诱导频率,而且操作简便,节省时间和用具,重复性好。本研究还将冬虫夏草浸出汁 与溶源菌?昆合后进行紫外辐射,通过几种方法进行比较,结果证明建立的新方法确实可行,易操作;同时也表明冬 虫夏草具有较强的抗紫外辐射作用。
Brief Reports

禽白血病病毒J亚群(ALV—J)的血清学调查及PCR诊断

成子强, 赵振华, 郝永清, 赵心力。, 哈斯阿古拉

2002, 17(4): 371

禽骨髓细胞性白血病(myeloid leucosis)(或称禽骨髓细胞瘤,myelcytomatomatosis)(ML)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus)J亚群(ALV—J)引起的禽的一种肿瘤性传染病u J,ALV —J是英国的Payne于1991年从肉鸡中分离出来的一个新的囊膜亚群[ , 。对AI v—J的原型株,HPRS一103的致病性和传播的研究中发现,本病毒能诱导肉鸡产生骨髓细胞瘤病(ML)、肾瘤和其它多种肿瘤,死亡率为1% ~2%,偶尔可高达20%。由于本病毒为AI V和禽内源性反转录病毒囊膜(E51)的重组体 .5 J,因此其可通过水平传播和垂直传播迅速地感染整个鸡群,使鸡群在短时间内遭受灭顶之灾。近十年来,在许多国家,包括美国在内的肉鸡中,MI已经是引起死亡和其它生产性问题的严重原因。

感染丝状蓝藻的噬藻体的裂解周期和释放量的测定

程 凯, 王春艳, 郭亚新, 石正丽, 赵以军

2002, 17(4): 374

近年来,随着浮游病毒的认识的深入,人们认识 到浮游病毒对水体中初级生产力的影响是巨大 的ll J,其主要证据就是发现噬藻体在海洋蓝藻的种 群控制上发挥着重要作用-2 J。噬藻体的释放量和裂 解周期是衡量噬藻体感染力的重要指标,很多重要 的生态指标如病毒在生态系统中对宿主的致死率、 病毒种群得以维持的阈浓度等都需要使用病毒的释 放量和裂解周期来加以推算l3· ,因此准确地测定 这两个基本参数是十分重要的。在自然界,很多丝 状蓝藻,如颤藻、鱼腥藻、螺旋藻、席藻等是能够形成 水华的,其中有些还具有产毒的功能l5 J。丝状蓝藻 的形态特征有别于单细胞蓝藻,在被噬藻体感染 时,丝状蓝藻的感染周期和光合生理也与单细胞蓝 藻有较大的差异l6 J,因此研究裂解丝状蓝藻的噬藻 体的方法可能不同于感染单细胞的噬藻体。本次试 验以一种感染丝状宿主的噬藻体为材料,探讨了确定其裂解周期和释放量的研究方法。
Review

分子伴侣与病毒糖蛋白

万 崎, 章晓联, 陈新文

2002, 17(4): 377

分子伴侣(molecular chaperone)的概念由Lasky 于1978年首先提出⋯ ,真核细胞内质网中的分子伴 侣是由多种蛋白质组成,它们可以介导新合成蛋白 质的正确折叠与装配,并在真核生物的细胞中广泛 存在。

猪流行性腹泻病毒分子生物学特征

张强敏, 郭福生, 尹燕博, 沈秋姑

2002, 17(4): 381

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED) 是以水泻、呕吐和脱水为特征的一种急性病毒性腹 泻。猪流行性腹泻现已成为世界范围内的猪病之 一 。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是PED的致病因子,是导致类似猪传 染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis, TGE)临床症状的真正病原。迄今为止已发现 PEDV与TGEV[ 、PEDV与PCV混合感染猪【 。 已有用蛋黄IgY预防PED效果的报道L3 J,还有用弱 化的PEDV疫苗对仔猪进行免疫的报道 ],但都对 其作用机制未作深入探讨。弄清PEDV 的分子生 物学特征,针对PED进行特异性免疫,必将对PED 的诊断、治疗和综合防治产生深远影响。本文仅就 PEDV的分子生物学特征作一综述。

Coltivirus病毒属研究进展

徐丽宏, 梁国栋

2002, 17(4): 385

Coltivirus病毒属(Coltivirus,Colti)为呼肠病毒科病毒,以科罗拉多蜱媒热病毒(Colorado tickfever virus,CTFV)为代表株,该病毒原为环状病毒属成员,由于其对人有致病性,可引起人的发热和脑炎,病毒核心的衣壳表面结构不同于典型的环状病毒,尤其是病毒基因组为12个双链RNA节段而不是环状病毒的10个节段,核酸分子量27×10 ,远比环状病毒(18×10 )大,故单列一属。目前全世界已在美洲、亚洲和欧洲等地分离到数十株Colti病毒(主要病毒株的分离年代和地区见表1)。其中CT—FV 和在德国、法国分离到的Eyach及其变异株Ar577和Ar578被称为欧美流行株,亚洲分离株除印尼的JKT6423、JKT6969、JKT7043、JKT7075分离株外,我国自1980年以来也从人、畜标本和野外采集的蚊虫及蜱标本分离到多株Colti病毒,如目前研究较多的有云南分离株Banna病毒,北京分离株BJ95—75、BJ95—70、TRT2,东北分离株NE97—12、NE97—31等,这些病毒与科罗拉多蜱媒热病毒在生物学特性及致病性等均存在较大差异。本文就Colti病毒的生物学特征、对人、畜的致病性与流行病学等进行了总结,特别是近年来国内外注重对Colti病毒的分子生物学特征研究,获得较多进展,由于病毒基因组已被阐明,对许多Colti病毒的生物学特性可以用分子生物学加以解释,作者将结合本人和国内的工作做一综述。