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2003年18卷1期

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Contents

HCV E2区基因在原核系统中的表达

张东伟 梁布锋 李东 祁自柏 凌世淦

2003, 18(1): 1

用提取的重组表达载体pET-E2转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG绣导,再进行SDS-PAGE,可得到有一条约34 kDa的表达带,与理论推测的蛋白分子量一致,通过Western-blot鉴定,证明此带即为目的蛋白带。该产物有一个六聚组氨酸尾,主要以包涵体形式存在;计算机扫描分析考马斯亮兰染色后的蛋白胶显示:目的蛋白占整个菌体蛋白的36%以上,经Ni-柱纯化的E2蛋白纯度可达95%以上;以纯化的E2蛋白为抗原,用ELISA方法检测了20份抗HCV阴阳性血清,结果表明15份抗HCV阳性血清中检出5份E2抗体阳性血清,而5份抗HCV阴性血清中没有检测到E2抗体。

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及表达

牟丹蕾.白雪帆, 李光玉, 潘蕾, 黄长形, 杨为松

2003, 18(1): 5

构建人整合素β3亚基全读码框(ORF)基因真核表达载体,为探讨整合素β3作为汉坦病毒(Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础。根据已公布的序列设计引物。用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因.应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切和PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序,序列分析表明与公布的人整合素β3亚基ORF核苷酸序列基本一致,并通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达,经间接免疫荧光法检测证实pcDNA3.1-β3能在宿主细胞中高效表达。

TTV武汉分离株DNA克隆和序列分析

李江, 叶林柏, 郜金荣, 吴正辉

2003, 18(1): 9

用PCR技术从一武汉病人血清中分离获得1TI DNA片断,把此DNA片断克隆到pMD18一T质粒载体中, 进行全序列测定并用计算机软件对核苷酸、氨基酸序列和ORF2多肽特征进行比较和分析。所分离获得的1TI DNA片断全长1333bD,含1TITV完整的ORF2及部分ORF1序列,核苷酸和氨基酸序列与其它基因型为1a的1TI 分离株具有极高的同源性。ORF2多肽含202个氨基酸, 在N端部分和C端部分具有较高的亲水性和较强的抗原 性. 而中问为一段疏水区域,抗原性较弱。N端结构以Of.螺旋为主,含有典型的酪氨酸激酶磷酸化价点(RARD. WPGY,38—45aa)和三个潜在的蛋白质激酶C的磷酸化位点;C端富含脯氨酸,结构以B转向为主,含有三个连 续的N一十四烷酰化位点,推测ORF2编码的蛋白可能是一种磷酸化蛋白。

汉滩病毒M 和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

张芳琳, 徐志凯, 罗雯, 阎岩, 吴兴安, 刘勇, 白文涛, 赵茜, 王海涛

2003, 18(1): 14

摘要:本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76一l18株M 基因G2片段与S基因5 端0.7Kb片段的嵌合基 因真核表达载体pcDNA3.1一G2s0.7及pcDNA3.1一SO.7G2;用该质粒免疫BALB,c小鼠,结果表明两种质粒免疫小 鼠可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)及糖蛋白(GP)特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高 于后者。淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1一G2s0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载 体对照组,而pcDNA3.卜SO .7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因 0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应 答。不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2SO.7这种拼接方式明显优于SO.7G2。

HSV一1感染人成纤维细胞中HTl 基因的生物信息学分析

刘龙丁, 施海晶, 董少忠, 董承红, 王丽春, 赵钢, 李琦涵

2003, 18(1): 18

依靠生物信息技术对HSV I型病毒刺激KMB一17细胞后克隆得到的差异基因HTRP和其编码蛋白序列的特 征进行了分析和顶测.初步推测了该基因的转录调控序列和编码蛋白的结构特点, 为深入研究病毒刺激后细胞基 因表达所编码序列的功能提供了基本数据。

HIV-1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

张颖 白雪帆 黄长形 孙永涛 潘蕾 李光玉 王临旭

2003, 18(1): 23

应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV—S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R—K-S—K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV—R—K—S—K融合表达载体。脂质体介导pCMV—R—K-S—K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞。结果表明构建的pCMV—R—K—S—K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验。

黄地老虎颗粒体病毒cDNA文库的构建

张伟, 王玮, 艾秀莲”, 谢玉清, 冯怀蓉

2003, 18(1): 27

:以感染黄地老虎颗粒体病毒 Agrotis segetum ganulosis virus,AsGV)的黄地老虎幼虫为材料提取总RNA、 分离mRNA, 并反转录合成cDNA,构建了包括黄地老虎(Agrotis segetum,As)幼虫和黄地老虎颗粒体病毒的 cDNA文库。用EcoR I和HindIII限制性内切酶酶切AsGV基因组DNA,制备地高辛探针.与上述总RNA、mR. NA、cDNA杂交,从文库中筛选出AsGV的阳性克隆1081个,经cDNA测序,cDNA编码序列与基因组编码序列 相符。并根据基因组阅读框序列合成引物,PCR扩增出59个阅读框的编码基因,也完全与基因组序列相符。

粘虫胚胎细胞系的建立及对MsNPV敏感性的测定

于洪春, 郑桂玲, 王晓云, 李国勋, 赵奎军

2003, 18(1): 31

用培养24h的粘虫受精卵成功地建立一株粘虫胚胎细胞后,命名为NEAU—Ms一980312, 目前已传代201 代.该细胞系主要含有圆形和纺锤形两种细胞,在28℃ 、l20h的细胞群体倍增时间为47.82h。该细胞系对粘虫核 型多角体病毒有较高的敏感性,用原代病毒以感染复数(m.O.i.)为0.08TCID ,细胞感染细胞,在接毒后lOd,病 毒感染率和每细胞产生的多角体数量分别是为62.10%和33.59PIB。

AcMNPV突变株的蛋白表达时相研究

丁清泉, 方勤, 戴顺英, 赵小东

2003, 18(1): 35

将苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒似utograph cdifomica nuclearpolyhedrosis virus,AcMNPV)的 野生型株HR3和温度敏感突变株ts317、ts538、ts8感染草地贪夜蛾(Spo,lopte~afrugiperda)Sf21细胞,并在允许 温度(25℃)或非允许温度(33℃)下培养,分别采用过氧化物酶标记的抗P47蛋白、抗P143蛋白、抗多体蛋白 和抗病毒结构蛋白的单克隆抗体检测病毒增殖过程各蛋白出现的时间。结果表明:1)P47蛋白是一种晚期 (12hpi)表达蛋白,各突变株在允许温度(25~C)能够表达,但在非允许温度(33℃)不能表达。2)P143蛋白是一 种早期(8hpi)表达蛋白,在允许温度和非允许温度时都能表达,ts8的表达量较少。3)在非允许温度条件下,蛋 白质的合成速度高于允许温度。41野生型和突变株ts317的病毒结构蛋白(P80、GP64、VI39、P24和唧在允 许温度增殖下都能检测到,ts538和ts8表达量相对少些。5)除了GP64和P24外,ts538和ts8感染的细胞在非允 许温度下不能表达病毒的结构蛋白。6)野生型毒株HR3在允许温度和非允许温度下的蛋白表达无明显差异。

单引物法扩增马尾松毛虫CPV基因组第8片段及其序列分析

胡建芳, 张珈敏, 杨娟, 邓晓军, 汪洋, 胡远扬

2003, 18(1): 39

本文利用T4 RNA连接酶将5’一磷酸、3’一氨基修饰的引物1连接到马尾松毛虫质型多角体病毒第8片段 dsRNA的3’~OH端。经逆转录、退火、补齐形成全长双链eDNA。使用单一的互补引物2进行PCR扩增。扩增产 物克隆在pMD18-T载体上。对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定.结果表明.克隆片段全长330bp,S’端 具有CPV—l型末端保守序列AGTAAA’端具有保守序列G rrAGCC。起始密码子从ATG位于38-4O残基.终止密 码子TAA位于1208~1210残基。推测S8片段编码390个氨基酸多肽,分子量为44kDa。与舞毒蛾质型多角体病 (LdCPV)第8片段相比较.核苷酸和氨基酸同源性分别为97%和98%。与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第8片 段相比较.核苷酸和氨基酸的同源性分别为83%和85% 。与人的呼肠孤病毒第8片段比较没有明显的同源性。

甜菜夜蛾核多角体病毒泛素基因的克隆及原核表达

牛国栋, 张小霞, 张忠信”

2003, 18(1): 44

甜菜夜蛾核多角体病毒(spotoptera exigua multi—nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)泛素基因“6函“itin被克隆 和序列分析,该基因编码区全长243bp, 编码8O个氨基酸残基, 预计蛋白质分子量为9.4kDa。将这一ubiquitin 基因克隆到原核表达载体pET一28a上,转化至BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对表达的条件进行了优 化。用异源的泛素单克隆抗体检测目的蛋白,Western blot实验证明所表达的蛋白是泛素蛋白。同时.我们制备 了特异性的抗体, 为以后的研究工作做了基础。通过计算机软件Gendoc对不同来源的泛素进行分析.结果显示. 病毒中的泛素与真核细胞中的泛素相比较,泛素的氨基酸序列有较大的变化,杆状病毒的泛素基因在分子进化上 可能有比较独特的途径。

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的 cDNA克隆及序列分析

文力, 张珈敏, 王 琼, 胡建芳, 胡远扬

2003, 18(1): 49

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子 经SDS一热酚法抽提。在使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA, 回收纯化第九片段S9。SgRNA双链经高 温变性,使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMDI8-T载体上。 利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段。序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片 段长677bp, 经过序列拼接,得到一个977bp的序列, 其中包含一个963bp大的开放阅读框(ORF)。推测 DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa。和家蚕1型质型多角体病毒的I株(BmCPV—I I strain)位于第九片段的NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86.0%和93.4% 。

玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因的克隆和原核表达

林 林, 吴云锋, 崔晓峰

2003, 18(1): 54

以玉米蚜杨凌生物型为材料,设计特异性引物采用PCR的方法在国内首先克隆了一种玉米蚜体内参与传 毒的共生菌groEL基因.序列测定结果表明:玉米蚜杨凌生物型共生菌groEL墓因全长为1647bp,编码548个氨 基酸, 登录Genebank.序列号为AF387863。构建了该基因的原核表达载体,用pBV221表达出63KDa的非融合 目的蛋白.用pET一30a表达出69KDa的融合蛋白,二者均有较高的表达量。

烟草脉扭病毒基因组鄙分序列的克隆和分析

莫笑晗, 秦西云, 杨程, 段玉琪, 吴娟, 李天飞, 吴建宇, 陈海如

2003, 18(1): 58

烟草脉扭病毒(Tobacco vein d~toaing virus, TVDV)是引起烟草丛顶病的两种病毒之一。TVDV被归为 黄症病毒科的暂定成员。应用黄症病毒科的通用引物和根据马铃薯卷叶病毒属成员核酸序列设计的简并引物.通 过RT-PCR从烟草丛顶病烟株总RNA中扩增到了TVDV基因组的部分序列。序列分析获得了长度为1654 bD的 序列,编码推测的TVDV复制酶基因的部分序列、外壳蛋白基因及运动蛋白基因的全部序列。根据这三个基因编 码的氨基酸序列构建的分子进化树分析表明,TVDV为黄症病毒科的确定成员。根据其基因间隔区的长度特征和 各ORF编码的氨基酸的分子进化分析,我们推测TVDV应当是马铃薯卷叶病毒属的一个新成员。这是TVDV的 分子生物学特征的首次报道。

烟草脉扭病毒基因组鄙分序列的克隆和分析

莫笑晗, 秦西云, 杨程, 段玉琪, 吴娟, 李天飞, 吴建宇, 陈海如

2003, 18(1): 58

烟草脉扭病毒(Tobacco vein d~toaing virus, TVDV)是引起烟草丛顶病的两种病毒之一。TVDV被归为 黄症病毒科的暂定成员。应用黄症病毒科的通用引物和根据马铃薯卷叶病毒属成员核酸序列设计的简并引物.通 过RT-PCR从烟草丛顶病烟株总RNA中扩增到了TVDV基因组的部分序列。序列分析获得了长度为1654 bD的 序列,编码推测的TVDV复制酶基因的部分序列、外壳蛋白基因及运动蛋白基因的全部序列。根据这三个基因编 码的氨基酸序列构建的分子进化树分析表明,TVDV为黄症病毒科的确定成员。根据其基因间隔区的长度特征和 各ORF编码的氨基酸的分子进化分析,我们推测TVDV应当是马铃薯卷叶病毒属的一个新成员。这是TVDV的 分子生物学特征的首次报道。

狂犬病病毒SRV9疫苗株糖蛋白核酸序列及抗原特性研究

袁慧君, 扈荣良“, 张守峰, 张茂林, 涂长春

2003, 18(1): 63

狂犬病病毒SRV。株是经克隆获得的中等蚀斑口服弱毒疫苗候选株,具有安全和免疫原性较好等优点。本 试验根据狂犬病病毒糖蛋白核苷酸5’末端和3’末端序列设计了一对引物,通过反转录一聚合酶链式反应(RT— PCR)分别扩增了SRV。及其母源株SAD BI9糖蛋白的全长cDNA。测序结果表明,SRV9和SAD B19糖蛋白 cDNA读框长1575bp,编码524氨基酸残基的多肽。通过和其母源株SAD BI9核苷酸序列比较发现,SRV 的 158、575、93l位碱基分别出现了G—A、A—G和A—G的转换, 相应地导致第53位、192位、3l1位氨基酸出 现了Gly—Glu、His—Arg、Th广+Ala突变;和我国现行的犬用疫苗株ERA的核苷酸和氨基酸比较,有l0个碱基 不同,7个氨基酸发生改变。经Jameson—Wolf抗原表位优势图分析发现,SRV。在192位氨基酸的改变,导致该 部位产生了一个新的潜在抗原位点。由于狂犬病病毒糖蛋白是诱导机体产生中和抗体唯一抗原, 因此,上述氨 基酸的改变可能与其特殊的蚀斑特性和其安全性提高有关。保持对毒株的氨基酸序列分析也是监测其特性的重 要手段之一。

传染性法氏囊病病毒不同分离株vp2基因部分核酸序列分析

王永山, 周宗安, 邓小昭, 赵新泰, 侯继波, 何孔旺, 丁铲, 刘玉, 高健, 刁振宇

2003, 18(1): 68

根据已报告的传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)cDNA序列,设计引物,用R r_PCR扩增CH (鸡)、DU (鸭)、GE (鹅)和SP (麻雀)四种不同源IBDV分离株的vp2基因高变区。核酸序列测定分析表明, 四种不同源IBDV分离株vp2基因高变区的同源性为97% . 推导编码蛋白氨基酸序列的同源性98% ,两个亲水区和七肽区的氨基酸序列完全一致。本研究结果提示, 自然感染IBDV 的鸭、鹅和麻雀不仅可成为病毒携带者或传染源,而且在病毒变异中起一定作用。

一株中华绒螯蟹呼肠孤病毒I A1 cDNA文库构建及其I A 聚合酶基因部分序列分析

张叔勇, Bonami Jean—Robert, 石正丽

2003, 18(1): 72

在中华绒螯蟹体内分离到一株呼肠孤病毒(命名为EsRV905株)。采用Trizol试剂提取病毒核酸,经聚丙烯 酰胺凝胶电泳.碎胶法回收基因组各节段。随机引物法合成第一节段的cDNA文库.胶回收试剂盒去除小片段, 平端连接于载体.化学转化,利用蓝自斑筛选阳性克隆子. 酶切鉴定重组质粒。从基因组第一节段的重组质粒中 选择2个插入片段约为1.5kb的质粒测序,结果得到包括RNA聚合酶主要特征性结构的一段序列。结果说明,这 株蟹呼肠孤病毒的RNA聚合酶定位于基因组第一节段。

利用异种动物抗血清双抗夹心法检测小麦黄花叶病毒

耿波, 韩成贵, 翟亚锋, 王慧清, 于嘉林, 刘仪

2003, 18(1): 76

Abstract:With purified Wheat yellow mosaic vires(WYMV) particles as antigen, cavy was injected to produce specific antiserum.Its titer was tested as Y1 28 by the method of micro-immunoprecipitation. Using cavy antiserum as capture antibody for trapping the virus and rabbit antiserum as detection antibody, the experiment system of heterogeneous animal DAS-ELISA (HADAS—ELISA)was established to detect WYMV.The system has the advantage of better specificity and sensitivity of detection.This method was proved to be successful and prattical in the detection of the virus in field—-collected sam-· ples, indicating that the experiment system of HADAS—ELTSA is superior to the indirect ELISA with rabbit antiserum only.

恒河猴外周血及肾组织SV40病毒基因分析

刘建生, 刘 馨, 徐冬蕾, 邵聪文, 侯宗柳

2003, 18(1): 79

In order to investigate the detection methods and gene structure of SV40 ST-ag and LT—ag— C in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and kidney cells from different Macaque monkeys, using PCR, 4 positive templates were obtained firstly, then 4 ST—ag gene fragments and 4 LT—ag—C gene fragments were achieved and sequenced. These antigens coding region of each isolate contain a number of nucleotide differences when compared to the reference strain SV40——776 and the laboratory strain SV40一B.These resuhs indicated that:1)SV40 DNA isolated from the PBMC and kidney cells showed essentially identical sequences for ST—ag gene and LT—ag—C gene. 21 the presence of viral DNA in P—BMC suggests that virus may spread with in the host by hematogenous routes. 3) a new SV40 strain predominates in our monkey population, it contains a specific nucleotide and amino acid changes in LT-ag—C termini, TCCTCACAG polynucleotide is inserted among nt2784/2783, SO SerSerGIn iS inserted after amino acid 678 residue.

水生呼肠孤病毒研究进展

方勤, 朱作言

2003, 18(1): 82

水生呼肠孤病毒为感染水生生物的一类呼肠孤 病毒。自Meyers等1979年首次报道水生呼肠孤病 毒的分离⋯.迄今已分离鉴定出40余株水生呼肠孤病 毒【2】。与哺乳动物呼肠孤病毒一样,水生呼肠孤病毒 主要通过呼吸肠道感染宿主. 导致出血病及肝脏与 胰腺疾病⋯.在全球范围内对水产养殖业造成了严 重威胁。水生呼肠孤病毒形态结构与呼肠孤病毒相 似.其基因组与轮状病毒11条基因节段的双链 RNA相吻合.但在遗传与抗原性上与轮状病毒无任 何相关性【41。本文综述了近年来水生呼肠孤病毒的 研究进展。

马铃薯X病毒分子生物学研究进展及其作为表达载体的应用

曲静, 郭兴启, 慈晓燕, 亓栋, 温孚江*

2003, 18(1): 87

马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)又称 马铃薯潜隐病毒(Potato latent virus)或马铃薯轻 花叶病毒(Potato mild mosaic virus),是马铃薯X 病毒属(Potexvirus)的模式成员,遍布于全世界 马铃薯种植区。受侵染叶片呈花叶症状, 田间常 与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产。 其病毒粒子为易弯曲的杆状颗粒, 大小约为 13nmx515nmtl】 近年来国内外对PVX基因组的表 达、系统侵染及其与马铃薯Y病毒属田间复合侵 染的机制有了大量的研究.尤其是PVX与寄主抗 病基因的互作及其作为表达载体的应用引起了众 多学者的研究兴趣.本文综述其研究进展。

J亚群禽白血病病毒研究进展

杨玉莹

2003, 18(1): 93

禽白血病病毒(Avian leukosis viruses,ALVs)是 以主要引起禽各种造血细胞肿瘤性增生为特征的一 类反录病毒群。由于其中一些毒株最先分离于所谓 的Rous肉瘤病毒(Rous sarcorr~viruses。RAVs),因此 又称为Rous相关病毒(Rous associated viruses, RAVs)I 1。从其所引起的肿瘤性疾病的病理学出发,此 群病毒又称为禽白血病肉瘤病毒群 vian leukosis sarcorr~groups ofretroviruses,ALSVs)。九十年代以 来,一种称之为骨髓性白血病的新生肿瘤性疾病在 世界各地肉鸡群中广泛发生【2-41。对骨髓性白血病病 例进行病毒分离,分离毒株显著不同于引起淋巴细 胞白血病的其他外源性亚群病毒,而命名为J亚群 (ALV—J)。本文扼要综述了有关J亚群ALV的研究进 展和一些认识。