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2003年18卷2期

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Contents

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

武汉大学生命科学院病毒研究所, 湖北武汉

2003, 18(2): 99

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR 方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm.T载体中,应用M13通用引物进行序列测定, 与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型。有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG 分别为preS1,preS2,和S的翻译起点。然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将SalI线性化的 pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德一毕赤酵母GS115His冲。通过MD.G418平板筛选和5’AOX1和3’AOX1 引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut 酵母工程菌株。此酵母菌株在合适的培养条件和甲 醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS.PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的 带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与I-IB~抗体阳性血清发生特异性反应。

汉滩病毒核蛋白与热休克蛋白GRP94、HSP27的相互作用

高 娟, 杨守京料, 孙玉静, 刘彦仿

2003, 18(2): 104

为研究汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染诱导乳鼠脑组织热休克蛋白G刚P94、HSP27与病毒蛋白的相 互关系,选出生2~3d的昆明乳鼠实验性感染汉滩病毒,取8d后发病乳鼠脑组织部分制石蜡切片,用免疫组化 结合共聚焦显微镜检测组织中病毒抗原及GRP94、HSP27的表达,部分制匀浆液,用ELISA、免疫共沉淀方法分 析病毒抗原和GRP94、HSP27的关系。结果示汉滩病毒感染诱导乳鼠脑组织神经细胞高表达GRP94且与细胞内 病毒抗原有共定位关系,但未见HSP27诱导高表达;免疫共沉淀显示汉滩病毒核心抗原(HINV-NP)与GRP94、 HSP27呈非共价复合物形式存在。该结果为进一步探讨HSPs在病毒感染复制中的作用以及抗病毒感染方面提供 了有意义的实验资料。

HPV16l1基因的克隆及其在真核细胞中的表达

吴琦 黄利鸣 卫洪昌

2003, 18(2): 111

克隆并表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期基因l1,以期为研制防治宫颈癌的DNA疫苗奠定基础。本实验采用PCR方法从质粒p16L1BN1中获得HPV16l1基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体中,核酸序列鉴定HPV16l1基因真核表达质粒构建成功,再用脂质体介导基因转染7721人肝癌细胞。转化阳性细胞经SDS-PAGE显示在分子量大约为55kDa的位置出现一条特异性条带,与HPV16L1分子量大小相符。表达产物经Western blotting分析:能与HPV16L1单克隆抗体特异结合。真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1构建成功并能在真核细胞7721中有效表达,为下一步进行动物DNA免疫实验奠定了基础。

PCR一微孔板杂交一ELISA法检测巨细胞病毒感染

严银芳, 阎远芳, 董长恒

2003, 18(2): 115

建立PCR.微孑L板杂交一ELISA法检测人血清标本中巨细胞病毒DNA。将5’端标记生物素的PCR扩增产 物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,90~C 2min,55"C,lmin杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定, 经酶标记抗地高辛标记抗体结合显色。本试剂检测灵敏度为2.5×104 copies/mL,比传统PCR和ELISA敏度性高, 特异性强,与单纯疱疹病毒I型和II型,风疹病毒、EB病毒、腺病毒核酸无交叉反应,批内CV为8.9%,批间 CV为10.5%。该法可用于定性和定量检测HCMV DNA。

马铃薯x病毒湖南分离物的鉴定与分组研究

杜志游 陈集双

2003, 18(2): 119

从湖南石门采集表现重花叶症状的马铃薯叶片中分离纯化到一株线状病毒HN021。经双链RNA(ds—RNA) 抽提、寄主反应测定、病毒粒子和内含体的形状观察, 初步确定该病毒为马铃薯x病毒(Potato virus x)。以 ds—RNA作为模板,用相应引物对HN021分离物的ORF4-UTR-ORF5片段进行RT—PCR,得到lkb左右的双链 cDNA片段。对该片段进行克隆和测序,并将测序所得的核苷酸序列与Genbank登录的11株不同分离物的相应 片段的核苷酸序列进行同源性比较和分析。结果表明,HN021与分离自南美洲的三株分离物(COAT,KPA 和 HB)的同源性为78-4%~79.4%,与其它8株(分离自亚洲、欧洲、大洋州和北美洲)分离物的同源性为96.4%一97.8%。 从氨基酸水平比较,HN021与COAT,KPA和HB三者CP和8kDa蛋白氨基酸序列同源性分别为86.5%~89.0% 和74I3%~75.7%,相应地与其它8株分离物的同源性分别为97.1%一98.7% 和97.1%一100%。序列分析的结果证实 了HN021分离物为马铃薯X病毒,同时表明PVX 明显存在两个组(组I和组II),HN021和其它来自亚洲、欧 洲、大洋州、北美洲分离物的组II,3个南美洲分离物属于组I。

建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术

陈玉栋, 张楚瑜, 邹俊煊, 潘兹书, 陈立新, 李田, 郭长林

2003, 18(2): 124

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5’非编码区设计一对引物和一条荧光探针,利用荧光定量PCR原理,结合 LightCycler检测系统,首次建立了定量检测猪瘟兔化弱毒苗方法。结果表明,该方法的灵敏度为l02拷贝数,线 性范围为lO 一lO ,达6个数量级;标准样品的变异系数为2-3%一5.1% (n=10),疫苗样品组内实验变异系数为 0.85%一2.8% (n=5)、组间实验为2.5%一7.3% (n=5),对同一样品分5次RNA提取和逆转录,其变异系数为5.O%; 对9份疫苗样品进行了检测,与兔体定型热反应方法相比较,有很好的相关性;整个检测过程仅需4h。该法可望 取代传统的兔体定型热反应用于疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提 供了一种新的、简捷有效的工具。

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

严维巍, 崔治中, 王永坤

2003, 18(2): 129

摘要:应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带, 将扩增产物提纯后克隆入pGEM -T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆, 序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它 国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%~99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%~99.1%, 为极度保守片段。

随机引物PCR扩增鸡胚致死孤儿病毒DNA 的研究

周 斌, 曹瑞兵, 芦银华, 陈德胜, 陈溥言*

2003, 18(2): 137

摘要:在电镜下观察鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒时,另看到一大小为70~80nm,无囊膜,20面体对称的病 毒颗粒。为了解该污染病毒,作者挑选了4条随机引物对此未知病毒分别进行反转录PCR和直接PCR扩增,结 果共扩增出3条基因片段,经测序(一个反应)后分析与禽腺病毒1型—— 鸡胚致死孤儿病毒基因组部分序列同 源性分别高达99.5%、99.6%和99.5%。从而得知鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒受到了鸡胚致死孤儿病毒的严 重污染。

禽I型副粘病毒厂基因克隆及序列分析

宋建领, 赵文华, 杨斌, 张永仙, 王金萍, 信爱国, 朱建波, 丛佩清

2003, 18(2): 141

用RT—PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽I型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其厂 基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽I型副粘病毒各毒株同源性为88.1%~94.9%,与疫苗株LaSom 和强毒株F48E9的同源性为85.6%。所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112~117aa)的氨基酸序列与强 毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株。鸽I型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMVZQ98—1 株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株。以1 662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒 属于基因Ⅶ型,鸽I型副粘病毒属于基因Ⅵ型。

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

邱德新, 陈焕春*, 万绍贵

2003, 18(2): 146

采用RT-PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(D 7),克隆到pMD18一T载 体构建成重组质粒pMD18N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCC VR.2332株的同源性为100%,表明off 7是PRRSV 基因组内很保守的序列:将of 7亚克隆到原核表达载体 pGEX.KG,构建成重组质粒pGEX—KGN,用pGEX—KGN转化表达菌株BL21,经SDS-PAGE和Western-blot分 析表明:克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融 合表达,表达的融合蛋白GST-N 分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清 学诊断方法的建立打下了基础。

包涵体一犬传染性肝炎病毒形态发生学的重要特征

常国权, 冯书章

2003, 18(2): 152

用免疫金电镜技术和电镜原位杂交技术观察了犬传染性肝炎病毒感染的犬肾传代细胞中的病毒包涵体,发 现这些包涵体具有以下三种基本形态:1.松散均质包涵体;2.副结晶色包涵体;3.致密颗粒包涵体。其中前 二种包涵体能被免疫金标记,它们是尚未成病毒粒子的病毒蛋白或是病毒装配后乘余的病毒蛋白,后一种包涵体 能被病毒DNA探针标记,是病毒核酸合成过剩而堆积起来形成的产物。此外,本文还描述和讨论了包涵体与细 胞及病毒发育成熟的关系。

口蹄疫病毒非结构蛋白3abc基因的克隆与表达

尤永进, 朱彩珠, 葛艳, 陈波, 张强, 饶忠, 徐泉兴, 卢永干

2003, 18(2): 155

摘要: 口蹄疫病毒(Foot.and.mouth disease virus,FMDv)非结构蛋白(NSP).3ABC可用于注苗与感染动物的 鉴别诊断,合成该基因的PCR引物,并在引物5’端和3’端分别加入含BamH I和Hind III限制性酶切位点序列。 以FMDV毒株基因组RNA为模板,利用RT.PCR技术扩增3abc基因,得到的基因片段与T载体连接,转化DH5 Q。提取重组载体pT.3ABC,经BamH I,胁d III双酶切后与载体pET32a连接,转化宿主菌BL21(DE3)plysS, IPTG 诱导表达目的蛋白。SDS.PAGE 及Western Blotting检测和鉴定结果表明,在大肠杆菌中成功表达了 NSP-3ABC蛋白,分子量约56kDa,且该表达产物可与FMDV感染的动物血清产生免疫反应。ELISA试验结果显 示,表达蛋白可用于FMDV注苗与感染动物的鉴别诊断。

牛疱疹病毒I型ul49(VP22)基因的序列分析及其表达

余晓岚, 肖少波, 方六荣, 金梅林, 陈焕春*

2003, 18(2): 159

以牛疱疹病毒I型(BHV—I)国内地方分离株感染的细胞培养物制备PCR模板,扩增出大小约O.77kb的 ul49基因完整编码区片段,将扩增片段克隆到pMD18一T载体中,获得含ul49基因的重组质粒pMD—VP22。采用 双脱氧末端终止法进行序列测定,发现与国外Cooper株ul49基因序列完全一致,说明ul49基因相当保守。进一 步将BHV—I ul49完整编码区片段插入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C1中,获得分别与6xHis融 合的原核表达质粒pET一28aVP22和与EGFP融合的真核表达质粒pEGFPVP22。将pET一28aVP22转化大肠杆菌 BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS—PAGE电泳检测发现在38kDa处有一条特异性的表达带。利用脂质体介导, 将pEGFPVP22转染PK一15细胞,经G418加压筛选,获得稳定表达VP22的细胞克隆。在倒置荧光显微镜直接检 测未固定的活细胞,发现pEGFPVP22转染细胞能发出很强的荧光并主要集中在细胞核中,而对照载体pEGFP.C1 转染细胞的荧光分布于胞浆。

猪瘟兔化弱毒E2蛋白A,D区的高效表达和蛋白纯化及其应用

苏小运, 缪德年, 许立华, 陈德胜, 陈溥言

2003, 18(2): 164

摘要:本试验对表达猪瘟E2囊膜糖蛋白的原核表达载体pET-E2的表达条件进行了优化,在此基础上,对表达的 蛋白质进行了纯化。在6 mol/L盐酸胍存在的条件下,将包涵体溶解在rifs.HCI中,并直接用于His Band亲和层 析。收集过柱产物并透析,在2%SDS条件下,对所得的重组蛋白质进行了定量。重组蛋白质被用来包被96孔 ELISA板并应用于免疫猪瘟抗体水平的测定。

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

丁清泉, 汪亚平, 朱作言

2003, 18(2): 169

摘要:草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属。序列分析表明, GCRV S2片段长为3 877核苷酸,编码一个分子量为138kDa的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质。为进一步了 解该病毒RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV.RdRp)保守区(约1.5kb)重组质粒 pR/RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA 聚合酶保守区N 端与C端部分基因的pR/RRpN 及 pR/RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达。筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分 别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白。Westernblot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV.VP2血清呈阳性反 应。通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90%纯的目的蛋白。上述结 果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据。

用基因芯片鉴定诊断四种水泡性疾病

秦智锋, 钟安清, 杨宝华, 叶奕优

2003, 18(2): 174

摘要:为了对临床上症状非常相似的四种水泡性动物疾病进行大批量、快速准确的检测,我们尝试用基因芯片技 术来对这四种水泡性疾病进行快速鉴别诊断。用Qiaquick 96 plate Kit对扩增的39个基因目的片段进行纯化,TE 调配浓度至0.361ag/laL,于GMS417点样仪上按预选设计好的布阵方式点样,然后经紫外灯照射进行紫外交联等 一系列处理。用Salmon进行非特异性杂交检测芯片点样的质量。大量抽提组织中FMDV和细胞上清液中的SVDV 的总RNA,随机引物反转录的同时采用随机荧光标记法,标记FMDV和SVDV。标记好的cDNA超声波随机打 断后进行特异性杂交,以最佳光扫描强度进行扫描,Imagene软件扫描结果,对两者信号进行对比,结合各病毒 相对应的坐标,可鉴别诊断出四种动物的水泡性疾病病毒。本方法不但快速、灵敏、准确性高,而且可实现对大 批量货物的集成化检测,满足我国快速通关的要求。

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

杨 娟, 张珈敏, 蒋 洪, 邓晓军, 胡建芳, 胡远扬*

2003, 18(2): 178

Abstract:A luciferase gene has been inserted into the recombinan t plasmid PIDNV—pUCl l9 which contained partly deletion of genome of Periplanete fuliginosa densovirus(PfDNV).The recombinant plasmid with luciferase gene was co··transfected with pfDNV·pUCl l9 into Periplanelefuliginosa larvae an d had a high luciferase gene expression in enteron of the tran sfected larvae.

芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株某些理化性质的研究

高建明, 张艳华, 王 艳, 彭建新*, 洪华珠

2003, 18(2): 181

关键词:DNA内切酶图谱;熔解温度;结构多肽; 多角体蛋白

猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速检测

芦银华, 许立华, 华修国, 谈国蕾, 黄伟坚, 陈德胜, 陈溥言

2003, 18(2): 184

Abstract:According to the published genome seqflences of Porcine circovirus type 2(PCV2)and Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),primers were designed and PCR, RT-PCR were set up for the detection of PCV2 an d PRRS respectively.W ith the established meth ods, 38 clinical samples from the respiratory disease pigs were detected for the presence of PCV2 an d PRRSV.The results demonstrated that 22 sam ples were posirive for PCV2,27 sam ples were positive for PRRSV an d am ong th e above positive sam ples,1 8 sam ples were positive fo r both viruses.The data obtained in the present study indicated that PCV2 an d PRRSV maybe play an important role in the course of the development of respiratory diseases.

单克隆抗体技术在水生动物病毒研究中的应用

单克隆抗体, 水生动物, 病毒病, 抗原表位, 疫苗

2003, 18(2): 187

单克隆抗体技术作为病毒病检测与防治的有 力武器,在人类、畜牧兽禽等的病毒病控制与预防 中发挥出日益显著的作用。从二十世纪八十年代中 期Chinchar等研制蛙虹彩病毒(Frog virus 3,FV3) 单抗开始⋯,这一技术及其研究成果也运用于水生 动物病毒学研究中。尤其是近年,人们对水产品蛋 白质不断增长的需求,使水产养殖业呈现突飞猛进 的发展势头,但普遍流行的水生动物病毒病已造成 巨大经济损失。滥用药物不仅防治效果差,而且严 重污染水体及生态系统。利用生物技术和环保方式 对水生动物病毒病进行防治,就成为人们关注的热 点。因此,单抗技术在水生动物病毒病研究中得到 越来越广泛的运用,并有新的进展。本文就此作一 综述。

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

闫 笑, 李天宪*

2003, 18(2): 191

传染性法氏囊病(Infection bursal disease,IBD) 是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传 染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自 IBDV 发现至今新的变异株不断出现,分子结构的 改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的 改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各 国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的 研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目 的。