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2003年18卷3期

Research Article

宫颈癌中p53表达和病毒感染的研究

周经姣, 刘建军, 徐顺先

2003, 18(3): 197

摘要:应用PCR对121例宫颈脱落细胞和组织分别检测HPV。16/18和HSV一2 DNA。同时应用免疫组化S—P法检 测76例宫颈组织中p53过度表达。结果发现,宫颈癌组织中HPV.16/18和HSV-2阳性率分别为61.3%和32.3%, 慢性宫颈炎组HPV一16/18和HSV一2阳性率分别为22.5%和20.0%,与正常宫颈组比较均有显著性差异。宫颈癌中 HPV一16/18和HSV一2混合感染率为16.1%。p53过度表达率在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌组织 中呈梯度递增。另外,宫颈癌组织中 3过度表达与HPV一16/18、HSV一2的感染无相关性。提示:宫颈癌的发生 与HPV一16/18关系密切,HSV一2可能与HPV一16/18协同作用导致宫颈癌的发生。宫颈组织中 3过度表达率与宫 颈癌的进程有关,这在宫颈癌的防治方面有一定的临床意义。

登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

高 阳, 江丽芳料, 方丹云, 曾祥凤

2003, 18(3): 201

摘要:将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动 子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN—E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测 pCxN2一E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,l5周 时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1:640:流式细胞计数仪(FAcs)检测DNA 免疫鼠CD4 、CD8 T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4 淋巴细胞水平略有上升, CD8+细胞水平有较大升高(p率为60%。以上结果表明:pCXN2.E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免 疫应答,尤其是MHC.I限制性杀伤性CD8 T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA 免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。

HCV E2蛋白诱导的体液免疫及CTL应答研究木

郭泰林, 叶林柏, 郜金荣, 吴正辉, 余应龙, 廖庆姣, 杨晓骏, 陈晓曦, 张源

2003, 18(3): 206

摘要:应用PCR方法扩增出HCVE2基因编码417a.a-~750a.a的DNA片段,克隆到原核表达载体pQE30 LacZ 启动子下游,转化JM109菌株。在JM109菌株中诱导表达出N 端含6个组氨酸的E2 融合蛋白,用 Ni—NTA—Superflow亲和层析柱纯化作为抗原免疫实验兔和BALB/c鼠。定期取免血,采用间接ELISA方法检测 兔子体内针对E2的抗体水平和维持规律。结果显示,距初次免疫14d兔子体内已有抗体产生,直至免疫第55d 抗体水平持续上升,之后抗体水平保持稳定,抗体滴度达到1:3200。六周后,取鼠脾脏制备淋巴细胞,定向刺 激扩增后与经过重组真核表达质粒pCE2转染的P815细胞作用,利用LDH释放试验检测作用效果。在E:T= 200:1的情况下,杀伤率超过30%。这些结果表明工程菌株表达的HCV E2蛋白具有良好的免疫原性,可以诱 发免疫实验动物机体产生较高滴度的抗体及特异性CTL应答。由此我们认为E2蛋白是发展HCV预防工程蛋白 疫苗的合适候选者。

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

赵小东, 韩峰, 王艳, 杨贵宾, 应革, 林勇平, 王璇, 吴淑华

2003, 18(3): 213

摘要:通过RT—PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与 腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组 腺病毒。经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达。重组病毒经滴 鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效 果优于灌胃组。

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

王大燕, 王健伟, 魏 强, 屈建国, 于修平, 洪 涛

2003, 18(3): 217

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用。分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSP4蛋白C端86-175氨基酸并用GlutathioneSepharose~(TM) 4B亲和纯化。将纯化蛋白分别以0.4nmol和1.5nmol的剂量腹腔注射新生Balb/C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况。当注射0.4nmol GST-NSP4_T重组蛋白时,有1只小鼠发生一过性腹泻(1/6),给予1.5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性。本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用。

XJ一160病毒复制子型表达载体的构建

杨益良, 梁国栋, 付士红, 苏乃伦, 邓 娟, 侯云德

2003, 18(3): 221

xJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构 建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点 的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和B一半 乳糖苷酶基因(1acZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA 转染 BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ.160病毒复制子型表达载体具有自主复 制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。

NDV CN株对几种人肿瘤细胞的杀伤作用及其机理的分析 徐葛

徐葛林, 解付磊, 全家妩

2003, 18(3): 227

本文研究了NDV-CN株对5株不同的人肿瘤细胞的体外杀伤作用。结果表明5株肿瘤细胞对NDV-CN敏感,于感染早期出现细胞收缩变圆,失去贴壁性,感染第5天时细胞存活率低于10%。其中尤以HEP3B细胞最敏感。但NDV-CN株对人二倍体细胞2BS有弱杀伤性。病毒感染早期可检测到感染细胞中有病毒核酸的复制、感染细胞表面有病毒蛋白的表达,胞浆内有病毒粒子存在。NDV-CN株主要诱导HEP3B及T24细胞产生凋亡,主要诱导Hep2、Hela及A549细胞产生坏死

一步法双重RT.PCR检测SARS冠状病毒技术研究

周敦金, 唐少文, 王斌, 杨华芬, 刁平, 许青, 刘斌, 杨继红

2003, 18(3): 232

参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,建立了一步法RT-PCR检测SARS相关冠状病毒的方法。利用该方法,对武汉市非典型肺炎疑似病例喉漱液进行了SARS相关冠状病毒检测,其中w20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,W1只有BNIin-s/as引物出现预期产物。同时我们将样品W20的RT-PCR扩增产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家分离的SARS冠状病毒基因高度同源性,这进一步说明RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段。在此基础上我们又建立了四种SARS冠状病毒一步法双重RT-PCR检测方法,在一个RT-PCR反应中用两套引物同时对SARS冠状病毒基因两个不同的片段进行检测,检测结果具有更高的特异性。

黑胸大蠊浓核症病毒对雌成虫生殖的亚致死影响

夏克祥, 汤显春

2003, 18(3): 237

用黑胸大蠊浓核症病毒(Periplaneta fuliginosa densonucleosis virus,PfDNV)三种浓度处理黑胸大蠊8-9龄雌性若虫,对雌成虫生殖有亚致死影响。试验结果表明,雌成虫寿命分别平均减少121d、145d和179d;产卵期分别平均缩短62d、56d和121d;每雌成虫产卵鞘数分别平均减少16个(占57%)、20个(占72%)和25个(占88%),每雌成虫产卵数分别平均减少354粒(占55%)、453粒(占71%)和558粒(占86%);生殖力分别平均下降177倍(占55%)、226倍(占71%)和279倍(占88%)。卵鞘活力分别下降28%、28%和20%。雌成虫在产卵盛期的前4个月持续受到DNV的影响,每雌每月平均产卵数分别减少30粒(占40%)、69粒(占48%)、63粒(占47%)和55粒(占50%),生殖力分别下降15倍、34倍、31倍和28倍。

中国棉铃虫核型多角体病毒VHA_(273)原毒株及其克隆株的比较研究

贾放 徐佳 聂英超 肖杨 周蕊 李小青 余泽华

2003, 18(3): 241

本文从形态结构、生物活性、核酸限制性内切酶图谱、结构多肽等方面对中国棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)VHA_(273)多粒包埋型原毒株及其单粒包埋型克隆株H_9进行了比较研究。它们对中国棉铃虫三龄初幼虫的LC_(50)值分别为2.987×10~4 PIBs/mL和1.647×10~4 PIBs/mL;当感染剂量为2×10~7 PIBs/mL时,其LT_(50)值分别是4.866d和4.797d。两个毒株的生物活性差别不大。经SDS-PAGE分析,两毒株结构多肽图谱带型相差较大。两毒株基因组经EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Hind Ⅲ和Xba Ⅰ消化后,得到的内切酶图谱表现为两毒株间有差别。这些差异的发现将有助于从分子水平揭示多粒包埋病毒和单粒包埋病毒形成原因。

马尾松毛虫质型多角体病毒S4的cDNA克隆及序列分析

赵淑玲, 梁昌镛, 洪靖君, 彭辉银料

2003, 18(3): 246

从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸, 回收、纯化第四片段S4,经RT-PCR 扩增得到了 S4的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明,S4全长由3 262个碱基组成,包含一个编码1058个氨基酸的完 整开放阅读框架。Blast同源分析显示,DpCPV S4与LdCPV S4、BmCPV S4和RRSV S2编码蛋白氨基酸的同源 性分别为94%、92%和22%。另外,氨基酸序列部分区域与Methanosarcina mazei Goel的甲基化转移酶有同源性, 且序列中含有鸟苷酸转移酶活性位点。

粘虫核型多角体病毒和颗粒体病毒侵染粘虫前胸腺的病理观察*

秦启联, 刘 强, 徐健, 李 碹, 苗麟, 丁 翠*

2003, 18(3): 251

摘要:观察比较了粘虫核型多角体病毒(Pseudelatia separata NPV,PsNPV)、粘虫颗粒体病毒(Pseudelatia separata GV,PsGV)感染粘虫, 以及两种病毒混合感染粘虫后,粘虫(Pseudelatia separata)前胸腺的形态特征和前胸腺 细胞的超微结构。结果表明,不同感染组粘虫前胸腺腺体都有不同程度的组织病变,PsNPV感染组在感染晚期与 前胸腺相连的气管严重病变,出现大量白色颗粒状物累积,被伊红染成紫黑色,腺体细胞被挤压变形;PsGV 感 染组的前胸腺腺体变小,单个细胞也小,细胞界限不十分明显;两种病毒混合感染组的腺体细胞小,能被伊红染 色的细胞极少。同时,前胸腺细胞的超微结构也有不同程度的病变。

双拷贝v-cath基因的重组HaNPV的构建及毒力分析

刘德立, 段媛媛, 齐义鹏

2003, 18(3): 254

摘要:利用HaNPV的Bac—to—Bac系~(Hanpvid)构建了双拷贝v—cath基因的重组HaNPV,即:除病毒自身的v—cath 基因外,还带有由iel启动子控制的早期表达v.cath基因的重组病毒dciHaNPV。Dotblot和No~ emblot分析证 明:重组病毒构建正确。用重组病毒感染Hz—AM1细胞,测定了dciHaNPV的TCID50为3.16~10 TCIDso/mL。

FMDV 0H99株基因组全序列的测定及其基因特征研究

刘光清, 刘在新, 张显升, 常惠芸, 郭慧琛, 李 冬, 刘相涛, 谢庆阁*

2003, 18(3): 259

采用RT-PCR方法对FMDV OH99株基因组全序列进行了分子克隆与测序。结果表明OH99株基因组全基因组序列长8040nt,其中5’NCR长1026nt,前导蛋白(L)编码区长603nt。该毒株结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6318nt,3’NCR长93nt,其后是poly(A)尾巴,测序结果表明该结构至少含有56个A。应用分子生物学软件,将OH99株与其它参考毒株进行了序列比较,并对其基因特征、推导的氨基酸序列进行了研究分析。结果显示,在分类地位上OH99株归属于O型FMDV,与OTY TW/97具有较高的同源性,而与其他参考毒株的差异性比较大,而且在基因组功能未知区域和3A编码区域具有两处明显的基因片段缺失现象,其中3A编码区缺失30nt,与OTY TW/97株相同,但功能未知区域的缺失状况与OTY TW/97稍有差异。根据VP1基因序列,对OH99株与参考毒株进行了系统发生树分析,分析结果表明OH99株与OTY TW/97株在同一基因型内,其遗传关系最近,而与其毒株遗传关系较远。
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鸡传染性支气管炎病毒LX4株mRNA5和mRNA6 cDNA的分子特征

刘胜旺, 杜恩岐, 孔宪刚, 杨增岐

2003, 18(3): 265

本研究参照已发表的IBV基因序列设计合成了一对引物,经反转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chin Reaction,RT-PCR)技术扩增得到我国地方分离株LX4 mRNA_5和mRNA_6的全部cDNA大小约1.7kb的片段。将该片段克隆并进行序列测定,与国内外部分参考毒株的相应序列比较分析发现:LX4 5a基因与已发表的国内外IBV毒株之间同源性很低,而这些参考毒株间5a基因同源性却很高(推导的氨基酸同源性在90%以上)。5b基因与国内分离株D971同源性最高。在所选的12株参考毒株中,LX4 N基因推导氨基酸同源性与国内分离株SD/97/02最高(94%),与HB次之(93%),与其他毒株核苷酸和推导氨基酸同源性在89%和92%以下。对已报道的N基因所编码蛋白的三个保守碱性区同源性比较发现,LX4在第66-88位与Beau、M41、H52及FIB同源性均为100%。在第181-234位,推导氨基酸同源性与SD/97/02最高(94%)。在第334-373位推导氨基酸同源性与H120和ZJ971推导氨基酸同源性均为93%,与其他毒株在82%以下。同时还发现在c末端350-409位,LX4与H120推导氨基酸的同源性为100%,与HB次之(98%),与其他毒株在95%以下。以上研究结果提示:我国地方分离毒株LX4 mRNA_5和mRNA_6 cDNA序列与国内其他分离株最高,表明与国内其他分离株具有较近的遗传衍化关系。但在N基因序列比较及对N基因编码蛋白的局部功能区比较分析发现,LX4与H52和/或H120存在很高的同源性,这表明LX4的存在可能与我国应用IBV疫苗株H52和H120有一定的联系。

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的稳定性研究

许振辉, 应松成, 沈超, 屈三甫, 郑从义, 王在时

2003, 18(3): 271

以本实验室建立的CSFV39-PK15持续感染细胞模型为实验材料,综合运用免疫荧光、RT-PCR、流式细胞仪,对其稳定性进行研究。实验结果均表明,该细胞模型有着良好的稳定性。即使在连续传至128代的CSFV39-PK15传代细胞中,CSFV仍持续存在:呈免疫荧光抗体反应阳性和RT-PCR检测阳性。同时,该细胞与正常的PK-15细胞相比,细胞周期无显著差异。通过同段序列的同源性比较,发现CSFV39与CSFV石门株的同源性最高,达99.02%。

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

丁巧玲, 李建军, 陈溥言

2003, 18(3): 275

将马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB。体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达。用pcDNA3-gB对AA肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免。间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次。之后2周攻毒,观察免疫保护效果。结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72.2%。

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达*

许立华 芦银华 胡志华 苏鑫铭 苏春霞 陈溥言

2003, 18(3): 279

本试验参照GenBank公布的Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)VR2332株的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,应用RT-PCR方法扩增出了PRRSV的核衣壳蛋白基因(N基因)。在对N基因及pET32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pETN。将pETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后,对培养条件及诱导表达条件(IPTG最佳浓度、作用时间)等影响表达的因素进行优化,实现了PRRSV核衣壳蛋白基因的高效表达

口蹄疫病毒感染BHK-21细胞的代谢热谱研究

吴继彬 刘欲文 张恒 顾潮江 郑从义 屈三甫 汪存信 常惠芸

2003, 18(3): 283

本文应用高灵敏度的LKB2277生物活性检测仪测定FMDV感染BHK-21细胞的代谢热谱,并与传统方法测定的一步生长曲线进行比较,二者具有显著的相似性。结果表明,微量热法通过对细胞及其受病毒感染的细胞体系代谢热的测定,能有效地监测病毒在宿主细胞内增殖的过程。该方法还提供了一种动态连续分析病毒感染增殖的新手段。

养殖贻贝中观察到一种球形病毒养殖贻贝中观察到一种球形病毒

王斌, 李 霞, 杨喜东

2003, 18(3): 288

提要:用电镜负染方法在发病的贻贝内脏团、鳃、外套膜组织匀浆中观察到一种球形病毒粒子,其直径为80~ 200nm,具囊膜。上述组织超薄切片发现在其结缔组织细胞质中均存在该病毒粒子,带双层囊膜,有“封入体” 结构,未见包涵体。在未发病的杂色蛤、香螺、牡蛎等内脏团中也观察到少量同种病毒粒子。用带病毒贻贝组织 匀浆投喂和划伤感染不带病毒的绣凹螺,使之成为带病毒状态。采用蔗糖梯度离心法,25 000 r/min,离心3h, 可于20%~30%蔗糖层间获得病毒沉淀带。 关键词:贻贝;球形病毒;病毒纯化; 电镜检提要:用电镜负染方法在发病的贻贝内脏团、鳃、外套膜组织匀浆中观察到一种球形病毒粒子,其直径为80~ 200nm,具囊膜。上述组织超薄切片发现在其结缔组织细胞质中均存在该病毒粒子,带双层囊膜,有“封入体” 结构,未见包涵体。在未发病的杂色蛤、香螺、牡蛎等内脏团中也观察到少量同种病毒粒子。用带病毒贻贝组织 匀浆投喂和划伤感染不带病毒的绣凹螺,使之成为带病毒状态。采用蔗糖梯度离心法,25 000 r/min,离心3h, 可于20%~30%蔗糖层间获得病毒沉淀带。
Brief Reports

金瓜和白瓜花叶病毒病病原的初步鉴定

陈晓斌, 顾振芳, 代光辉, 黄丹枫, 朱宗南

2003, 18(3): 292

The mosaic disease samples of Cucurbira pepo L.vail ov~ra and Cucumis melo L.vat. conomon were collected in greenhouse an d field at various sites in Congming Islan d.After host bioassay, electron microscopy(EM)observation,DAS—ELISA testing and molecular detection,the results showed that the pathogen of mosaic virus in e pepo L.var.ov~ra and C melo L.var.conomon is Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV).

对虾白斑综合症病毒与虾鳃细胞膜特异性结合关系的确立

易志刚, 解飞霞, 贾佩侨

2003, 18(3): 295

Abstract:Cell membran e extracted from shrimp gill was coated on 96 well plate and bound witIl DIG labeled White spot syndrome virus(wssv),then detected with Anti—DIG—Fab—HRP system,meanwhile taking the cell membran e from hepatopancreas,muscle,and E.coli for control group,the result verified the specific binding between W SSV an d gill cell membran e .And here the binding assay can be employed as a convenient an d rapid way to evaluate the binding nature between W SSV an d the shrimp gill cell membran e.
Review

丁型肝炎病毒的分子生物学研究进展

李晓娟, 况二胜, 杨复华*

2003, 18(3): 298

丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus,HDV)是一 种缺陷病毒,必须在嗜肝DNA病毒的辅助下才能 复制并组装成有感染性的病毒颗粒【l】。其毒粒为直 径35"--37nm,大小介于HBV的Dane颗粒和HBsAg 颗粒之间的球形颗粒。病毒颗粒外层由脂双层和 HBsAg 组成, 内包含由HDAg和HDV RNA基因 组结合组成的核蛋白体。HDV是目前所知唯一具有 共价闭合环状负链RNA 基因组的动物病毒,其基 因组与感染植物的类病毒和卫星RNA 十分相似, 即为通过分子内部碱基互补配对折叠形成的高度 碱基配对区和单链环状区相间的稳定棒状结构。 HDV基因组RNA和反基因组RNA 上有许多开放 阅读框(oRF), 目前仅明确反基因组RNA 上的 ORF5的功能是编码HDAg。虽然HDV基因组较小, 结构简单,但其几乎所有的复制事件都需要宿主细 胞的参与,分子生物学方面的内容相当丰富。

非典一SARS一冠状病毒*

王汉中, 丁清泉

2003, 18(3): 303

002年11月,一种神秘不明的疾病出现在我国广东省继而肆虐全球,世界上有27个国家和地区相继报道出现这种疫情。由于这种疾病的症状不同于典型肺炎,故初期称之为“非典型肺炎”(简称“非典”)并沿用至今。其学名应称为“严重急性呼吸综合征”(Severe Acute Respiratory Syndrome)

SARS病毒与动物冠状病毒的比较

陆承平

2003, 18(3): 307