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2003年18卷5期

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Brief Reports

轮状病毒vp8基因在原核系统中的初步表达

郝永华, 匡治州, 许 杨

2003, 18(5): 411

通过RT-PCR反应获得轮状病毒Wa株vp8基因的cDNA片段,将其克隆入pGEX一5X一1表达载体中,构 建重组质粒pGEX—VP8,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆子并对插入片段vp8进行序列测定,诱导后通过 SDS—PAGE检测重组蛋白,并观察表达量随时间变化的特征。结果显示,测序结果与vp8序列一致,VP8蛋白的 表达量在诱导后6-8h达到高峰。

H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋I~t(NS 1)基因的克隆与表达

刘金华, 吴清民, 史为民, 郭玉璞

2003, 18(5): 503

由于H9N2亚型禽流感对我国的养鸡业已造成 了很大的损失,因而在我国许多养鸡场不得不使用 H9N2亚型禽流感灭活苗⋯,但由于灭活苗的使用, 而增加了H9N2亚型禽流感的监测难度。因此,建 立一种能区别自然感染鸡和疫苗免疫鸡的鉴别诊 断方法已被提到日程上来。

利用超氧化物歧化酶增加棉铃虫病毒的感染性

周明哲, 孙新城, 胡志红, 孙修炼

2003, 18(5): 506

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa arm igera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HaSNPV)是棉铃虫的专一性病原,具有宿主特异 性高、不影响天敌、不污染环境、对人畜安全等优 点,在我国作为商品生物杀虫剂已有l0余年的历 史。
Research Article

含HTNV S基因重组痘苗病毒在HFRS患者B淋巴母细胞系中的表达

王平忠, 白雪帆, 潘 蕾, 张颖, 黄长形

2003, 18(5): 415

摘要:采用Ficoll密度梯度离心法(淋巴细胞分离液)分离肾综合征出血热(HFRS)患者外周血单个核细胞(PBMC),并用EB病毒(EBV)感染B淋巴细胞,建立永生化的B淋巴母细胞系(B—LCL)。然后,用含汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)S基因的重组痘苗病毒感染B—LCL,应用间接免疫荧光检测核衣壳蛋白的表达。结果表明,B淋巴细胞经EBV感染4周左右,可形成永生化B—LCL。成功转化后的B—LCL,体积增大,且增殖的淋巴细胞积聚成团。汉滩病毒s基因在B—LCL中能有效表达核衣壳蛋白。含s基因的重组痘苗病毒感染的B—LCL可用作HTNV 核衣壳蛋白特异性C几活性研究的靶细胞

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

王平忠, 白雪帆, 潘 蕾, 张颖, 黄长形

2003, 18(5): 420

摘要:运用限制性内切酶Xba I、Sal I对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-1 gag基因,并与真核表达载体pCI-neo 连接,构建含有中国流行株HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI.neoGAG。经Xba I/Sal I双酶切及测序鉴定证实, 成功地构建了HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI.neoGAG。通过脂质体将pCI—neoGAG转染入p815细胞,G418 筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物。结果表明所构建的HIV-1核心蛋白真核表达载体能在p815 细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础。

HCV la/lb型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

王宏卫, 朱诗应, 戚中田

2003, 18(5): 423

摘要:采用HCV la/lb嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Western blotting检测HCV蛋 白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV)la和lb型嵌合体全长cDNA在HepG2 细胞中的复制和表达。结果证明,转染细胞中检测到分子量约70kDa的HCVNS3蛋白,转染细胞连续传2O代,仍 能检测到HCV正、负链RNA。表明该HCV 嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV lb型的RNA依赖的RNA 聚合酶(RdRp)可以起始含la型非编码区的病毒复制。HCV 5 端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸 改变可不影响其与核糖体结合。3 非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失“A”,9409,9410 位及9495,9496,9497位分别插入“1Tr”和“AAT”可不影响RdRp的生物活性。本研究对阐明HCV复制和翻 译机制有重要意义。

汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达

李光玉, 黄长形, 潘 蕾, 牟丹蕾, 李新红, 张 颖, 杨为松, 白雪帆

2003, 18(5): 428

本文为建立分型检测方法,探讨了汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性。首先,分 别构建编码HTNV核蛋白及其羧基端多肽的原核表达载体pRSETA—S、pRSETA—S—C;然后,将其转化入表达菌 BL21(DE3)pLySs诱导表达,采用SDS—PAGE、Western.blot进行鉴定。我们成功构建了pRSET A—S及pRSET A—S—C 原核表达载体。SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达,呈不溶状态,Western.blot显现目的蛋白具有良好的抗原性。 为大量制备分型用核蛋白多肽抗原创造了条件

人B组轮状病毒vp7基因的克隆和序列分析

唐少文, 小林宣道, 杨继红

2003, 18(5): 432

摘要:利用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增了人B组轮状病毒WH.2vp7基因,连接到克隆载体pUCm—T, 并对其基因序列进行了分析。WH一2与ADRV的同源性达98%,与印度加尔各达分离株CAL.1达92%,而与动 物B组轮状病毒同源性差别较大,如与IDIR(鼠)同源性仅为58%,与WD653(牛)B组轮状病毒同源性为63%。 与ATI(牛)同源性为61%。对vp7基因的一-~级结构分析发现其mRNA折叠形成多达18个发卡环状结构。vP7 蛋白是249个氨基酸组成,分子量为28.4kDa,含有3个潜在的N连接的糖基化位点和多个磷酰化位点,从氨基 酸序列的同源性来看,WH一2与ADRV的同源性达99%,与CAL一1达95%,而ID 仅为51%,说明了WH.2和 ADRV的起源相同。此研究对了解B组轮状病毒基因的进化和变异规律具有重要意义,也将为B组轮状病毒预防 性疫苗的研制提供科学的依据。

RT-PCR方法扩增白蛉热病毒M 片段的研究

刘东瀛, 郭广松, 叶梦贻, 杨占秋

2003, 18(5): 437

摘要:为建立扩增未知序列白蛉热病毒M 片段的RT-PCR方法,本研究选取7个血清组成员和8个未分组血清型, 共42株白蛉热病毒为RT-PCR检测对象。通过排列GenBank中已知的4型白蛉热病毒M片段氨基酸序列,选择 保守区设计引物。根据保守区各已知病毒的cDNA特异序列合成寡核苷酸,将相同区的寡核苷酸等量混合成为“鸡 尾酒”引物,用于RT-PCR。扩增产物经电泳检测,纯化后直接测序。引物对Ph—M一2FM 和Ph.M-3RM扩增产物 长度约为600bp,从42株病毒中扩增出34株,阳性率为81.0%。另一引物对Ph-M一2FM 和Ph.M.4R2M扩增产物 长度约为1400bp,扩增出22株病毒,阳性率为52.3%。测出序列经BLAST检索,与GenBank中已知白蛉热病毒 同源。本研究首次成功地应用RT-PCR扩增不同血清型未知序列白蛉热病毒的部分M 片段,并测出扩增产物序列, 为白蛉热病毒属成员的基因鉴定和种系发生关系分析提供了实验手段,并将有助于白蛉热病毒感染的基因诊断。

表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

戴凯凡, 刘颖, 周小云, 王芙, 段丹丽, 吴岚, 赵斌, 邵一鸣

2003, 18(5): 441

摘要:为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pVI75转移 质粒,并将HIV-I中国主要流行株B’/c重组株CN54 gagpol基因置于pVI75的启动子pE/L下,构建重组质粒 pVI75一Gagpol。重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞。前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的 基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的 白色重组痘苗病毒。结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的?180基因 和lacZ基因已丢失:PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Westernblot结果证实该重组病 毒能很好地表达目的蛋白。

病毒性趋化因子vMIP2的表达、纯化及生物活性研究

马新锋, 张治平, 杨继红, 胡勤学

2003, 18(5): 446

摘要:趋化因子受体如CCR5和CXCR4是HIV侵入细胞的辅助受体,趋化因子与其受体的结合可以抑制HIV感 染细胞。近年来在疱疹病毒8(Human herpesvirus 8,HHV8)基因组中发现与人趋化因子有较高同源性的开放阅 读框,分别命名为vMIP1、vMIP2和vMIP3。研究发现vMIP2与多种人趋化因子受体有高亲和力。本研究在大肠 杆菌中表达出融合蛋白TrxA—vMIP2,用亲和层析的方法对其纯化。纯化产物用肠激酶酶切后,经离子交换层析 纯化出目的蛋白vMIP2。体外活性研究表明纯化的vMIP2可以有效地抑制R5和X4 HIV-1在人外周血单核细胞 上的复制。

SARS病毒核蛋白基因的克隆及其表达研究

朱函坪, 陆群英, 卢亦愚, 姚苹苹, 徐 芳, 葛 琼, 翁景清, 严菊英, 龚黎明, 施 雯, 赵芝雅, 朱智勇

2003, 18(5): 451

摘要:从一例输入性传染性非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增出SARS病毒核蛋白 基因片段,克隆入质粒载体pUCm—T后,进行核苷酸序列的测定及分析,与已公布的SARS病毒基因序列进行比 较,证实为SARS冠状病毒核蛋白基因。为了解该病毒核蛋白的抗原特性,将核蛋白基因插入表达载体,构建重 组质粒pET28a—SN,转导大肠杆菌BL21(DE3)后,加IPTG诱导表达。产物经SDS—PAGE电泳分析,表达出相 对分子量约为50kDa的蛋白,占整个菌体的45%左右。Western—blot分析表明,表达产物仅与SARS阳性病人血 清起反应,而与正常血清不起反应。间接ELISA免疫检测,抗原滴度达l:12500。表明表达的核蛋白为SARS特 异性抗原,这为SARS病毒的诊断试剂的研制提供了方便而安全的抗原来源。

禽白血病病毒J亚群内蒙株的分离与鉴定

杨玉莹, 叶建强, 赵振华, 秦爱建, 顾玉芳

2003, 18(5): 454

摘要:本研究从曾见典型禽骨髓性白血病(Myeloid Leukosis,ML)病例的内蒙古某肉种鸡场随机选取的淘汰肉种 鸡中,分离出一株J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus Subgroup J,AL、,_J)。利用PCR和间接免疫荧光反应 进行鉴定,J亚群禽白血病病毒内蒙株可以被两对ALV_J特异性引物扩增(特异条带约2.2kb和545bp):且在特 异性单抗的间接免疫荧光检测中呈现强阳性荧光反应。此外,对山东一例肉种鸡骨髓性白血病病例亦进行了J亚 群禽白血病病毒的分离与鉴定。2.2kb PCR扩增物的测序结果表明,两株分离病毒的同源性为96.9%,与已分离 的SD9901和YZ9901株ALV_J同源性达94.2%,-05.4%。

口蹄疫病毒持续感染细胞系的快速选择及其特性研究

顾潮江, 郑从义, 吴继彬, 屈三甫, 杨 薇, 常惠芸

2003, 18(5): 459

摘要:采用NH CI弱碱法处理感染口蹄疫病毒的叙利亚仓鼠肾细胞系(BHK一21),存活细胞经过单克隆和选择,获 得32株阳性克隆细胞株。随机选取一株(BHK—ROp),常规传代并采用RT-PCR,透射电子显微镜,流式细胞仪进 行持续感染特性分析,结果表明,BHK—ROp第4,l6,36代细胞中病毒持续存在,但不影响细胞的生长特性, 表现出病毒持续感染的基本特征。可见,NHaCI弱碱法用于建立病毒持续感染细胞系是十分有效的

两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较

丁清泉, 汪亚平, 朱作言

2003, 18(5): 464

摘要:水生呼肠孤病毒为感染水生动物的一类病原体,隶属于呼肠孤病毒科新建水生呼肠孤病毒属。草鱼呼肠孤 病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起中国南方淡水养殖草鱼暴发性出血病病原,鲅鱼呼肠孤病毒(Threadfin reovirus,TFV)是引起海水养殖鲅鱼病毒病病原。本研究将GCRV与新加坡TFV分离株进行了部分特性比较研 究。结果表明,GCRV 与TFV均能感染CIK细胞,但对其它鱼类细胞系的敏感性有所差异。此外,凝胶电泳与 逆转录聚合酶链式扩增显示,GCRV与TFV核酸属不同的基因型。在多肽特性上,证实了GCRV的5条主要结 构多肽具有与F1’V及水生呼肠孤病毒相似的特性。Western blot检测显示,草鱼呼肠孤病毒与TFv结构蛋白拥有 部分相同的抗原决定簇

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

张雪莲, 范伟兴, 周玉传, 缪德年, 钱莺娟, 陈溥言

2003, 18(5): 468

摘要:提取马立克氏病毒I型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR一技术扩增出病毒生长非必需的US2 基因并克隆入T-easy载体。将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了 含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP。用脂质体将其与CVI988株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯 化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP, 因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似, 体内分离到表达绿色荧光的病毒。 并分别测定其在体内和体外的生长情况。表达EGFP基 体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

代春铭, 张晓燕, 邵一鸣, 沈荣显

2003, 18(5): 473

摘要:将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE/L启动子下游,通 过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK 区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒r、,v.DLVenv和rw.LNenv, Western blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫 小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫 效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28%。本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础。

亚洲小车蝗痘病毒增效因子的初步研究

李永丹, 赵朝阳, 王丽英

2003, 18(5): 478

摘要:OaEPV经2×SDS包涵体碱性裂解缓冲液裂解,离心,分别用上清液及沉淀与绿僵菌孢子混合感染黄胫小 车蝗,上清液的增效活性比沉淀大2.5倍。用三种不同方法(2×SDS包涵体碱性裂解液法,0.02 mol/LNaOH裂 解法,8 mol/L尿素裂解法)裂解OaEPV所得蛋白液与绿僵菌混用,生测结果表明,包涵体裂解液法制备所得蛋 白增效活性最高,NaOH裂解法次之,尿素裂解法制备的蛋白几乎没有增效活性。将OaEPV 用包涵体碱性裂解 液裂解后,用葡聚糖G一200凝胶柱层析进行分离,出现两个洗脱峰,这两个峰的洗脱液浓缩后进行生物测定,初 步表明增效作用主要为第二个峰的蛋白片段。经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳,第二个峰的蛋白片段的分子量为40 kDa左右。

棉铃虫核型多角体病毒sod基因在大肠杆菌中的表达

高国辉, 张传溪

2003, 18(5): 482

摘要:用PCR方法从棉铃虫(Helicoverpa armigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV) C1株基因组中扩增 sod基因编码区,克隆到pGEM—T-easy vector,测定了核苷酸序列。将基因编码区克隆到原核表达载体pETblue2, 构建了含表达质粒pETblue2/HaSNPV SOD,转化大肠杆菌DE3(BL21)进行IPTG诱导表达。SDS—PAGE分析 表明SOD 的表达量约为细胞总蛋白的37%。邻苯三酚法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白 中表达产物校正酶活力单位为694 U/mg。

黑胸大蠊浓核病毒分类的相关研究

李 莉, 郭海涛, 张珈敏, 胡远扬

2003, 18(5): 486

摘要:黑胸大蠊浓核病毒(pfDNV)是在我国首先发现并正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒。该病毒属细小病毒科 (Parvoviridae),浓核病毒亚科(Densovirinae)。但对该病毒的归属问题却一直没有确定,本文对此予以探讨。pfDNV 的最新研究进展包括两个方面:全基因组核苷酸序列的测定,以及利用低温电镜技术和像重构方法对该病毒的三 维重构(分辨率23 A)。在此基础上,本文将pfDNV与其它病毒在基因组结构和三维结构方面进行了全面的对比 分析,其结果并不支持目前对pfDNV的分类, 因此建议对该病毒重新进行分类。

茶尺蠖病毒杀虫剂田间使用技术的研究

殷坤山, 陈华才, 唐美君, 郭华伟, 肖 强, 姚惠明

2003, 18(5): 492

摘要:茶尺蠖病毒杀虫剂应在每年茶尺蠖第1、2代和第5、6代的1~2龄幼虫期使用。在7.5×109~ 15.0×109 PIB/hm 的使用剂量下,幼虫期的防治效果可达98%以上。采用不同的喷雾器、不同的用水量及不同的喷施方式 喷施,对防治效果无影响。但挑治和丛面喷施可大幅度节约防治成本费。

水稻矮缩病毒非结构蛋白基因 6的表达和抗血清的制备

马中良, 杨怀义, 田 波*

2003, 18(5): 496

摘要:绎RT-PCR扩增⋯水稻矮缩病毒(RDV)中国分离物非结构蛋白基因s6,并克隆至pGEM-Teasy载体上。 序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子。将s6基因克隆到表达载体 pGEX一6P—l,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达。以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔, 制备抗S6 白的抗血清,ELISA 测定表明,该血清与抗原共价特异件反应,抗血清的效价为1:3000.Westernblot 印迹实验表明该抗血清能特异性榆测RDV感染的水稻组织中的s6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分 子手段。

风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2重组体的构建表达与抗原性分析

王小凡, 王志玉, 薛永磊, 姚 苹

2003, 18(5): 500

风疹病毒(Rubella virus,RV)是人类最重要、最 常见的致畸病毒之一,但其致畸机理至今尚未完全 明了[11 o RV的包膜上镶嵌着两个糖蛋白E2和El, E2/E1以异二聚体的形式在病毒体表面形成刺突结 构I引。E2的糖基化程度很高,存在O一联及N一联糖 基化位点,糖类在成熟的E2蛋白中所占比重大于 三分之一,E2蛋白的糖基化程度影响蛋白功能,糖 基化位点的改变可能与RV减毒有关。
Review

NS3蛋白在黄病毒科病毒生命活动中的作用

上海师范大学生命科学学院生物系, 上海, 武汉大学生命科学学院, 湖北武汉

2003, 18(5): 508

黄病毒科病毒包括三个属, 即黄病毒属 (Flavivirus), 瘟病毒属(Pestivirus)和丙型肝炎 病毒属(Hepacivirus)。这些病毒均能引起人和动物 患严重疾病。黄病毒属黄热病毒(Yellow fever virus.YFV)、登革病毒(Dengue virus,DEN)能引起 发烧、出血,患者死亡率极高,瘟病毒属牛腹泻病 毒(Bovine viral diarrhea petivirus。BVDV)、猪瘟病 毒(Classical swine fever virus,CSFV)等能引起其 各自宿主家畜患严重疾病。近年来,又发现丙型肝 炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)与人类原发性肝 癌和肝硬化密切相关。然而, 目前仍没有对各种黄 病毒科病毒有效的治疗方法。尤其是近年来干扰素 对丙型肝炎治疗的疗效低,反复率高,使得研究更 为有效的抗病毒药物成为各种病毒疾病治疗中亟 待解决的问题之一。在BVDV的研究中发现,当非 结构蛋白NS3蛋白与NS2蛋白一起以复合物的形 式存在时,病毒对其寄主是非致病性的;而当NS3 蛋白独立地存在时,病毒颗粒是致病性的lI J。这提 示NS3蛋白很可能与病毒的致病性密切相关。而 且, 序列分析表明非结构蛋白NS3 (nonstructure protein 3)是黄病毒科病毒中最为保守的非结构蛋 白。后来许多研究证明NS3蛋白参与蛋白质水解加 工,以及病毒的复制,对病毒的生命循环是必需的。 因此,NS3蛋白成为了人们研究的一个热点。