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2004年19卷1期

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Research Article

细胞间接触是EB病毒自发感染人类上皮细胞的有效途径*

江培洲*, 沈新明, 吕丽春, 黄 华, 姚开泰

2004, 19(1): 1

选用产EB病毒的绒猴淋巴细胞B95-8系和补体受体2型 (complement receptor 2, CR2)与多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)表达阴性的人永生化上皮细胞Hacat系共培养,进行细胞接触感染实验。一周后去除B95-8细胞,仅留Hacat细胞,并以自行改进的方法鉴定前者是否得以彻底去除。在证实没有B95-8残留后,PCR和原位杂交分别检验剩余Hacat细胞中EB病毒的感染结果。实验结果表明:改进的方法能够灵敏和简便地判断B95-8细胞的污染与否,并且与B95-8细胞接触共培养的Hacat细胞能被EB病毒有效地感染,后者暗示了EB病毒对上皮细胞可能存在细胞融合和CR2或pIgR介导之外新的感染途径。本研究在一定程度上简化了前人的细胞接触感染方法,也为建立天然的EB病毒自发有效地感染上皮细胞的模型奠定了基础。

牛血清中27 kDa蛋白的免疫学特性研究*

邵先安, 沈 燕, 徐 薇, 王 缨, 胡新美, 熊思东*

2004, 19(1): 6

为探讨牛血清中存在的HBsAg样蛋白的性质,给HBV的发病机制、治疗、预防等研究提供依据,我们采集93份牛血清,以SDS-PAGE、Western Blot对血清中HBsAg样蛋白进行研究,发现其分子量约为27kDa;以SDS-PAGE分离牛血清中的HBsAg样蛋白,经皮下多点免疫小鼠,可产生与人HBV编码蛋白HBsAg反应的抗体。表明该27kDa蛋白可能存在与HBsAg相似的免疫学特性。

HIV-1结构蛋白gag-gp120与白细胞介素2联合基因免疫*

江文正, 金宁一*, 李子健, 张立树, 张洪勇

2004, 19(1): 10

在真核表达载体pVAX1中的CMV启动子下游插入IL-2基因,构建真核表达质粒pVAXIL2。将它与表达I型人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus 1, HIV-1) gag-gp120的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌肉注射BALB/c小鼠,免疫3次后,以ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HIV-1抗体水平,结果显示联合免疫组小鼠在免疫2周后已有抗体产生,6周后进入高峰。乳酸脱氢酶释放法检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性,结果显示联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性显著高于pVAXGE单独免疫组(P0.05)和载体质粒pVAX1对照组(P0.01)。以上结果表明:HIV-1核酸疫苗质粒pVAXGE与真核表达质粒pVAXIL2联合免疫可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答,且免疫应答水平高于pVAXGE单独免疫组,IL-2发挥了免疫佐剂的作用,增强了核酸疫苗的免疫原性。

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

李兰娟, 卢亦愚, 翁景清, 严菊英, 吴南屏, 沃健儿, 龚黎明, 朱函坪, 李敏红, 陆群英, 程苏云, 张严峻, 姚苹苹, 梅玲玲, 王志刚, 茅海燕

2004, 19(1): 14

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变。从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株。对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙江省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近。

赤羽病病毒核蛋白基因克隆和序列分析*

花群义, 张念祖, 杨晶焰, 徐自忠, 杨云庆

2004, 19(1): 18

参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAV BHK21细胞培养物中提取总RNA,对AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析。与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94.2%~98.3%,推导的氨基酸的同源性为97.6%~100%,证实为AKV的N基因。为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础。

FIV gp40 七肽重复区基因的克隆表达及其产物的纯化

王春平, 朱杰青

2004, 19(1): 22

本研究利用Learn Coil-VMF程序预测到FIV Env蛋白gp40存在两个七肽重复区(Heptad repeat,HR1和HR2),对包括HR1和HR2在内的部分gp40胞外区基因(称为HR1-HR2)进行了人工合成,以此基因为模板获得了HR1和HR2基因的扩增产物,同时构建了用氨基酸连接子SGGRGG将HR1和HR2连接起来的串联基因(即HR1linkerHR2,命名为2-Helix),采用大肠杆菌GST融合表达系统对HR1、HR2和2-Helix蛋白进行了表达,并对2-Helix进行了纯化。同时利用凝胶过滤层析证明2-Helix在PBS缓冲系统中以寡聚体的形式存在。

A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其HA基因序列分析

许传田, 范伟兴*, 赵宏坤

2004, 19(1): 27

从山东各地疑似流感发病猪分离到10株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型。将其中一株Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素全基因(HA)进行克隆与测序,与GenBank收录的其它猪流感和禽流感H9N2 亚型的HA基因进行比较,发现Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素基因在核苷酸序列方面同广西1999年分离的禽流感毒株Ck/GX/99(H9N2)和2000年云南分离的禽流感毒株Ck/YN/2000(H9N2)的同源性最高;进化树分析表明Sw/SD/1/2003 (H9N2) 起源于禽源的H9N2亚型流感病毒;Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点与其他H9N2亚型不同,Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点是R-S-L-R-G, 而其它猪流感和禽流感H9N2亚型都是R-S-S-R-G

鸡 γ-干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定

蔡梅红, 曹瑞兵, 谈国蕾, 陈溥言

2004, 19(1): 32

以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素成熟蛋白的基因,把它与非融合表达载体pRLC相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。把表达产物进行变性,复性,纯化后加入鸡胚成纤维细胞上,用水疱性口炎病毒进行攻毒,测出鸡重组γ干扰素的活性单位为1.0×106U/mL,获得了满意结果。

引致河蟹颤抖病的病毒的核酸定性*

陆承平

2004, 19(1): 36

对河蟹(中华绒螯蟹)“颤抖病”病毒及其核酸进行了电镜观察。纯化病毒经负染后由电镜观察显示,病毒粒子呈球状,有囊膜和纤突,直径约为150nm。纯化病毒经核酸酶降解杂核酸后,加入8mol/L尿素释放病毒核酸,经水相法展开后,用覆有碳膜的铜网取样,再经染色和真空镀膜,于电镜下观察。病毒核酸呈单股线状,底片经光学精确放大后,测定了核酸分子的长度,根据经验公式计算出病毒核酸分子量为5.05×106。抽提的病毒核酸在0.8%琼脂糖凝胶电泳中呈单一条带,大小为15~16kb,经核酸酶酶切显示,核酸对DNase I不敏感,对RNase、Mung Bean Nuclease敏感,根据以上特性判断,该核酸为ssRNA。

从茶尺蠖中分离到一株微小RNA病毒

王小纯, 张珈敏, 刘传凤, 余海洋, 胡远扬*

2004, 19(1): 39

从核型多角体病毒(NPV)感染致死的茶尺蠖幼虫尸体中分离到一株微小RNA病毒(EoPV)透射电镜观察纯化的病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒。16%的SDS-PAGE显示它有两个分子量为31.5 kDa和28.8 kDa的衣壳蛋白,后者的含量是前者的2.5倍。3′端克隆序列分析表明EoPV基因组3′有poly(A)尾,编码RNA聚合酶(RdRp),含有微小RNA病毒RNA聚合酶的八个保守基序,同源性分析表明它与榕透翅毒蛾微小RNA病毒(PnPV)亲缘关系最近。这些特点表明该病毒为一株新的微小RNA病毒。

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的 构建及其杀虫活性

乔 红, 姚伦广, 德格晶, 齐义鹏*, 周文科, 王志民

2004, 19(1): 43

用Bac-to–Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cryIAc10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP, 用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白。同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133.3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高。生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的。

利用双杂交系统对SeNPV泛素与抗细胞凋亡 蛋白相互作用的研究*

牛国栋, 张忠信*

2004, 19(1): 49

本文报道利用酵母双杂交系统研究甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的泛素(Ubiqutin)与抗细胞凋亡蛋白(IAP2, IAP3)相互作用的结果。使用Clontech 公司的MACHMAKER GAL4 Two-hybrid system 3,以病毒ubiquitin基因与酵母GAL4的DNA结合域重组表达“诱饵”蛋白,以病毒iap2或iap3基因与DNA活化域重组表达“猎物”蛋白,在低严谨型筛选培养基上均得到阳性克隆。这一结果表明,甜菜夜蛾核多角体病毒泛素与IAP2或IAP3在体外能进行相互作用,这种作用利用了酵母内源性E1和E2。SeNPV的抗细胞凋亡蛋白(IAPs)可能是泛素-蛋白酶水解途径(UPP)中的泛素连接酶(E3),或者是泛素依赖性蛋白水解酶的靶底物。

一种食用菌提取物y3对烟草花叶病毒的钝化作用及其机制*

吴丽萍, 吴祖建, 林奇英*, 谢联辉

2004, 19(1): 54

测定了从食用菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中提纯的y3蛋白对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的钝化作用,结果表明y3对TMV有较强的体外钝化作用,在心叶烟枯斑寄主上对TMV的抑制中浓度约为2.0μg/mL;y3在pH9.0时较稳定;TMV与y3混合后用RNase处理,测得侵染率为61.74%,比未用RNase处理的对照降低了38.26%,说明y3具有一定的体外脱衣壳作用;另外电镜观察发现y3可使部分TMV粒体发生裂解,变短。

紫外光和日光对噬藻体PP活性的影响*

夏燕华, 赵以军, 石正丽

2004, 19(1): 58

分别研究了实验室条件下紫外灯照射及不同季节中日光照射对噬藻体PP活性的影响。结果表明紫外光(UV-A和UV-B)对噬藻体PP有较强的致失活作用,并且其致失活作用强弱与波长有关。日光的作用下,夏季时噬藻体PP的日失活率为88.60%,冬季时为58.86%。同时发现不同季节中,尽管在某些时段的日光强度相似,但噬藻体PP失活率的差别却较大,这一现象可能是由于光质不同引起的。上述结果有助于解释淡水环境中噬藻体种群大小的季节性波动。

水体病毒浓缩条件的优化*

郑耀通, 林奇英, 谢联辉

2004, 19(1): 62

病毒浓缩条件的优化是水环境病毒污染监测及灭活去除效率评价的基础,本文开发了在待浓缩水样中预先加入钠化蒙脱石吸附病毒以增加其沉降性能,并在优化絮凝条件下用聚合氯化铝絮凝沉淀蒙脱石钠的水体病毒浓缩方法。该方法对人为污染的脊髓灰质炎病毒(Poliovirus 1, PV1)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、大肠杆菌噬菌体(Phage of Ecoli, E.cp)在闽江水、生活污水、自来水中分别有高于84.3%的浓缩回收率,说明该浓缩方法具有较广泛的适用性和应用前景,可为水体病毒污染监测及灭活去除评价提供一个简便、回收率高、成本低的浓缩方法。
Brief Reports

番茄烟粉虱传双生病毒PCR检测*

何自福*, 虞 皓, 罗方芳

2004, 19(1): 67

From the conserved regions of the reported nucleotide sequences of whitefly-transmitted geminiviruses (WTGV), a pair of degenerate primers was designed to anneal to the conserved sequence. The tomato samples infected geminivirus-like from Guangdong were detected by PCR. The results showed that a 356bp specific fragment was amplified from the samples. The specific fragment was cloned and sequenced, and the sequence was compared with all nucleotide sequences in GenBank by Blast of NCBI. The result showed that the fragment belonged to Geminiviridae DNA. So the degenerate primers may be used to detect the WTGV from tomato in Guangdong. Moreover, both of the homology of the fragment between WTGV from tomato in Guangdong and the reported WTGV in the world and WTGV from tomato in Guangxi were under 82%. These results implied that the WTGV from tomato in Guangdong differed from the above-mentioned WTGV.

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

王福祥, 孙永涛*, 王临旭, 王久平, 王平忠, 白雪帆, 黄长形

2004, 19(1): 70

To construct the eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 gene and observe its expression in vitro, the recombinant expression vector pVAX1GP120 was constructed by inserting the gp120 gene into the eukaryotic expression vector pVAX1. The pVAX1GP120 was transfected into Vero cells by lipofectamine and the expressed product was detected by indirect immunofluore- scence. Restriction enzymes digestion analysis and sequencing results revealed that the recombinant expression vector pVAX1GP120 has been constructed successfully. The indirect immunofluorescence result showed green fluorescence on the membrane of transfected cells. The constructed eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 can be expressed in vitro, which lay the foundation for the further study of HIV-1 DNA vaccine.

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达*

郑兰艳, 罗恩杰, 李新鸣, 张小棠, 鲁润铭

2004, 19(1): 73

To improve the effect of the gene immunization against Hantaan virus, we constructed the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) containing Hantaan Virus S gene coding region and CpG motif by cloning S gene segment with CpG motif into eukaryotic expression vector pTARGETTM. After conformed by enzyme analysis, the recombinant expression vector pTARGET-hans(ISS) was transferred into Vero-E6 cells by electroporation and the transient expression of Hantaan virus nucleocapsid protein was detected by indirect immunofluorescence assay(IFA). In some transferred Vero-E6, the green fluorescence was showed, thus we can conclude that the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) was successfully constructed and expressed in vitro, which will lay a foundation for further animal vaccination.

云南五个不同地区烟草花叶病毒外壳蛋白基因的序列比较*

张丽珍, 杨录明, 汪继玲, 李滟芳, 张仲凯

2004, 19(1): 76

Five Tobacco mosaic virus isolates, obtained from tobacco leaves showing typical symptom in Qujing, Honghe, Dali, Chuxiong and Yuxi in Yunnan province, were selected and studied from 637 TMV samples. Using a pair of primers specific for TMV-U1 strain, a specific fragment of 530bp including the TMV coat protein gene was amplified using IC-PCR. The products of PCR were cloned and sequenced. The nucleotide and amino acid sequences of the coat protein of the five isolates were found to be very similar each other and have more than 90% sequence identity with TMV-U1, TMV-B, TMV-P, TMV-FUJIAN, although minor differences existed among them. The results showed that the five isolates from Yunnan province belong toTMV-U1 strain.

基因芯片技术检测肾综合征出血热病毒核酸的研究*

朱 进, 陶开华, 操 敏, 张 云, 李越希*, 张锦海, 唐家琪

2004, 19(1): 79

To establish a rapid, sensitive and specific diagnostic assay for Hantavirus with microarray techniques, specific primers and probes were designed according to the conservative and specific DNA sequence of 76-118 strain and R22 strain. The probes were spotted on glass slides to form microarrays. The Cy3-labled single stranded DNA fragments prepared by dissymmetical PCR were hybridized with the probes on the glass slides. The microarrays were scanned and analyzed with a scanner. The results showed that the DNA microarray could detect the different typed DNA of HTN and SEO with adequate specificity and sensitivity. The developed DNA microarray and techniques might be a very useful method for diagnosis and prevention, and could be widely applied in specific pathogens detection of infectious diseases such as hemorrhagic fever with renal syndrome.
Review

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展*

王 舒, 袁 丽, 胡志红*

2004, 19(1): 82

HIV疫苗研究进展

王芳宇, 罗进贤*, 张添元

2004, 19(1): 87

西尼罗病毒研究进展*

刘卫滨, 梁国栋*

2004, 19(1): 92