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2004年19卷5期

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Research Article

TT病毒ORF2在Cos7细胞中的表达及蛋白质定位

何 燕, 叶林柏*, 李 礼, 廖庆姣, 特马力, 佘应龙, 叶 力, 吴正辉

2004, 19(5): 431

应用PCR方法从含有TT Virus ORF2的质粒pET-His- TTV2中扩增出606bp的蛋白质编码区,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1中以表达成GFP-VP2融合蛋白。构建出的重组质粒pEGFPTTV2经过酶切分析和PCR鉴定。用脂质体介导法将pEGFPTTV2质粒DNA转染Cos7细胞,通过RT-PCR分析,证实细胞中存在ORF2基因的转录产物。用共聚焦显微镜结合PI染色技术研究TTV VP2蛋白在细胞中的分布情况。结果表明,TTV VP2分布在细胞质中和细胞核膜内侧。因此推测VP2作为一种非结构蛋白,功能可能是参与病毒DNA的复制或转录。

HIV感染导致MT4细胞蛋白表达差异的初步研究

应天翼, 庄道民, 鲍作义, 刘思扬, 李韩平, 刘永健, 王恒良, 黄留玉, 李敬云

2004, 19(5): 435

为了比较MT4细胞株感染HIV-1的ⅢB株前后的蛋白质表达差异,我们分别提取MT4细胞及感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的MT4细胞的总蛋白质,通过双向电泳分离,使用Image Master 2D Elite 3.10图像分析软件分析获得的凝胶图谱,寻找差异点,使用质谱仪鉴定获得的差异点蛋白质。结果表明感染HIV和未感染HIV的MT4细胞有40个蛋白质点差异,HIV感染后减少的蛋白质点有12个,增多的有28个,通过质谱分析,29个蛋白质得到鉴定。其中HIV感染后下调的蛋白质有能量代谢相关蛋白、肌动蛋白相关蛋白及假想蛋白等;上调的蛋白有肌动蛋白、酶类蛋白、免疫蛋白及假想蛋白等。通过研究我们可以看出宿主细胞感染HIV病毒后有多个蛋白发生变化,可能和HIV与宿主细胞的相互作用有关。为了研究HIV感染的机制必须去除高丰度蛋白,针对特定功能的蛋白质进行具体研究。

从HFRS患者的PBMC建立BLCL及其意义

潘 蕾, 白雪帆*, 黄长形, 李光玉, 陈伟红

2004, 19(5): 439

体外研究汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV) S基因及其5’端、3’端在BLCL(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line, BLCL)内稳定表达的意义, 为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础。本研究从肾综合征出血热(HFRS)患者的外周血单个核细胞(PBMC)建立与HTNV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系,将含有不同HTNV S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,作为靶细胞系,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系。设计4条引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S基因全读码框(37-1326bp)及S基因5’端(37-501bp),S基因3’端(502-1326bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N、pcDNA3.1-S-C真核表达载体,并通过脂质体转染至BLCL细胞中,进行了稳定表达。间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N、pcDNA3.1-S-C在BLCL细胞中的表达。pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N、pcDNA3.1-S-C真核表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中长期稳定表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义。建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应,平均杀伤率分别为50.2%、39.0%和25.4%。HTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端。

我国中部HIV-1 B′亚型分离株基因组结构特征及系统发育分析

冯福民, 李敬云* *, 鲍作义, 庄道民, 刘思杨, 李 林

2004, 19(5): 444

为了分析河南省Human immunodeficiency virus-1(HIV-1)流行株的基因特征和传染来源,我们从一位HIV-1感染的有偿献血员体内分离HIV-1毒株。提取感染细胞的全基因组DNA,扩增病毒全基因组,Walking法测得全长序列。与HIV-1 RL42和HIV-1 HXB2株比较,分析基因特征。用Anthewin软件比较分析CNHN24株和RL42株env蛋白的二级结构。用Clustal软件对国内HIV-1分离株和国际参考株的全基因组、env基因和V3环基因分别进行了系统发育分析。结果发现,CNHN24株为HIV-1 B′亚型,富含嘌呤,含量达到60.26%。与RL42株及HXB2株比较,pol基因和gag基因变异度较小,env基因及非结构基因变异度较大。与RL42株相比,env蛋白二级结构变异不大,但env保守区C4的氨基酸呈高度变异。系统发育分析显示,CNHN24株与RL42株遗传距离最近,HIV-1 Lai株和HXB2株次之,与国内的HIV-1 B/C及AE/BC重组毒株的遗传距离较远;从V3序列的比较可以发现,CNHN24株与来自云南省的毒株HIV-1 CR206及RL42遗传距离最近。认为HIV-1 CNHN24株可能由云南传入。

流感病毒ns1基因的克隆及其原核表达载体的构建

张志珍, 洪文珊, 李康生

2004, 19(5): 449

为了解H5N1亚型流感病毒株的ns1基因特性及其规模制备NS1蛋白,首先将病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增流感病毒全长ns基因。测序显示H5N1亚型流感病毒NS1 cDNA全长678bp,编码225个氨基酸。BLAST分析表明,Qa/ST/852/01 (H5N1)病毒株ns1基因与近年来从华南地区分离的禽H5N1毒株的ns1基因有很高的同源性。之后采用PCR方法扩增ns1基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T-3载体中,与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因融合,构建重组质粒pGEX-4T-3/NS1 cDNA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。SDS-PAGE和凝胶扫描分析,GST-NS1融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,并且以可溶形式存在,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的28.5%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%以上。经免疫印记证实重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。该表达载体的构建为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备提供了基础。

PMWS病猪猪圆环病毒2型全基因组序列分析*

冯志新, 范伟兴, 李晓成, 李玉峰

2004, 19(5): 454

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法直接从5省病料中分别扩增出5个PCV2毒株的全基因组,分别命名为FujianPCV、GuangxiPCV、HainanPCV、HunanPCV和ShandongPCV。将扩增片段克隆于pMD 18-T载体,进行序列测定,结果表明,除FujianPCV株核苷酸长度为1768 bp,其余四株均为1767 bp。应用DNAstar序列分析软件分析表明,本实验的5个PCV2分离株与世界上其它地区的PCV2分离株密切相关,核苷酸序列同源性达93%~98.8%,与PCV1毒株的序列同源性只有68.4%~70%。其中ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为98.1%~99.4%和88%~99.1%。

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

宋 岩, 李一经*, 魏丽丽, 于小龙, 樊 琛, 师东方

2004, 19(5): 462

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp~750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Western blot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Western blot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合 感染的流行病学调查*

芦银华, 张素芳, 陈溥言

2004, 19(5): 467

根据GenBank上发表的PRRSV ORF7、PPV VP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法。应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52.3%;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26.9%。另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7.5%。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。

JDV与三种牛反转录病毒相互关系的初步研究*

尹红艳, 邓 刚, 莎日娜, 乔文涛, 耿运琪, 陈启民*

2004, 19(5): 471

为研究JDV与其它三种牛反转录病毒BIV、BLV、BFV的相互作用关系,将以JDV、BIV、BLV、BFV的 LTR为启动子,以Luc为报告基因的质粒和以上病毒反式激活因子的表达质粒共转染BL12细胞系,通过瞬时表达分析试验证明了JDV和BIV的LTR和Tat之间亲缘关系很近,能够相互激活;JDV Tat可以反式激活BLV LTR,BLV Tax不能激活JDV LTR;JDV LTR上存在BFV Tas的应答元件;BLV、BFV和BIV的LTR和反式激活因子间不存在相互激活。

猪繁殖与呼吸综合征病毒orf7和orf5双基因的原核表达研究*

乐 敏, 邱德新*, 陈焕春, 蒋增海

2004, 19(5): 476

根据PRRSV已知序列设计两对引物,采用RT-PCR方法分别扩增orf7和orf5基因片段。利用EcoRI、Spe I和Hind Ⅲ位点将orf7和orf5基因片段依次克隆到pMD-18T载体,构建成重组质粒pMD18NE,并比较所克隆基因序列的同源性。将串联的orf7和orf5基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建重组原核融合表达质粒pGEX-KGNE,并转化BL21,SDS-PAGE和Western-blot分析表明: orf7和orf5基因与GST获得了融合表达, 并且表达的融合蛋白GST-NE具有免疫学反应活性,这为猪繁殖与呼吸综合征血清学诊断方法的建立及疫苗研究打下基础。

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析*

夏咸柱, 胡桂学, 谢之景, 杨松涛

2004, 19(5): 481

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362 bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株S基因相比,S基因核苷酸序列同源性在40.2%~99.5%之间;推导的氨基酸序列同源性在15.9%~99.0%之间。DXMV株S基因变异区主要集中在该基因前1/2处,其中350-370、439-478、1718-1818三个区域碱基变异较大,而1060-1700区却十分保守。基于S全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和US patent株亲源关系最近。推导的DXMV株S蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc-1弱毒多一个;其中第566-568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。

犬瘟热病毒南京株H蛋白基因的克隆与表达

莫小见, 郭爱珍, 陆承平*

2004, 19(5): 487

根据发表的犬瘟热病毒(CDV) 参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以犬瘟热病毒南京株(CDV NJ-15)感染的Vero细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出1.9kb的全长H蛋白基因,双酶切该全长基因,得到1058bp片段,以正确的阅读框架定向克隆于pET-28b(+)中, 然后将重组质粒转化宿主菌RosettaTM,在37℃1.0mmol/L IPTG诱导下获得良好表达。经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白质约38kDa,与预期值一致。免疫转印试验显示,该重组蛋白可被CDV Onderstepoort 兔抗血清识别,表明该重组蛋白具备部分抗原性。

一株H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定*

唐利军, 雷富民, 安学芳, 范兆军, 李天宪

2004, 19(5): 490

2004年1月湖北宜昌某鸡场暴发疫病,从该鸡场濒死鸡肺组织中分离到了一株病毒,电镜切片观察到典型的禽流感病毒粒子;采用ELISA检测禽流感抗原为阳性;RT-PCR扩增HA、NA基因并测序,经BLAST分析,HA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) HA基因同源性为97%;NA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) NA基因同源性为96%,确定该分离株为禽流感病毒H5N1亚型(A/Chicken/Yichang/Lung-1/04(H5N1))。

小菜粉蝶颗粒体病毒颗粒体蛋白基因的序列测定及在大肠 杆菌中的表达

陈 可, 张珈敏, 胡远扬*, 刘传凤

2004, 19(5): 493

根据颗粒体病毒颗粒体蛋白(Granulin)基因在其起始密码子上游的12个碱基高度保守序列(TATAAGGAATTT)以及大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)的颗粒体蛋白基因的序列[1]设计引物,PCR扩增得到850bp左右大小的片段,核苷酸序列测定结果表明该病毒的granulin基因全长为855bp,起始密码位于第38~40位碱基,终止密码位于779~781位碱基,编码框序列全长为744;推测该基因编码一段由247个氨基酸组成的多肽,分子质量约为2. 9178×104道尔顿。与其它颗粒体病毒颗粒体蛋白基因进行同源性比较,核苷酸同源性都在70%以上,氨基酸同源性都在75%以上,最高的为大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV), 核苷酸同源性为97%,氨基酸同源性为98%。构建了重组表达载体pet-28a-Gran,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测,表明获得了颗粒体蛋白基因在大肠杆菌BL21中的特异表达。

苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒AcMNPV P78/83 蛋白初步研究*

聂英超, 方明刚, 余泽华, 陈新文

2004, 19(5): 498

AcMNPV ORF9 编码病毒核衣壳蛋白P78/83,该蛋白在宿主细胞内以磷酸化和去磷酸化两种形式存在,能够与细胞骨架成分肌动蛋白相互作用,序列分析表明其具有与WASP蛋白类似的结构,推测可能在病毒粒子的包装、运输等过程中起重要作用。本文利用Bac-to-Bac系统构建了P78/83与绿色荧光蛋白融合表达的重组AcMNPV,激光共聚焦显微镜观察表明,重组病毒感染Sf21细胞12h后绿色荧光主要集中分布于细胞质中,24h及以后绿色荧光主要集中分布于细胞核中。感染试验表明,超表达P78/83对病毒的生长无明显的影响。

灰斑古毒蛾核型多角体病毒三个晚期表达因子基因*

顾奇伟, 杨丽荣, 严兴成, 尚金燕, 高 瞻, 张传溪*

2004, 19(5): 504

将灰斑古毒蛾(Orgyia ericae)单粒包埋型核型多角体病毒(OrerSNPV)基因组DNA的各EcoRI酶切片段进行克隆和测序。序列分析结果表明EcoRI-M(3.0kb)与EcoRI-P片段(2.2kb)相连处含有编码晚期表达因子(LEF-2)的开放阅读框(ORF)。同时在EcoRI-E(约10kb)片段两端分别含有lef-3和lef-11基因的部分序列。lef-2基因编码区由648bp组成,可编码216个氨基酸残基的多肽,预计蛋白质分子量为23.7kDa。将OrerSNPV LEF-2氨基酸序列与其它已知的27种杆状病毒的LEF-2序列比较,发现OrerSNPV与其它鳞翅目NPV LEF-2氨基酸有35%~49% 同源性,其中与BusuSNPV、MaMNPV-A、HezeSNPV、HearSNPV和LdMNPV 同源性最高,和GV有26%~31%同源性,与膜翅目松柏锯角叶蜂NPV的同源性为32%,与库蚊杆状病毒的同源性只有23%。根据氨基酸序列绘制的分子进化树表明28种杆状病毒lef-2基因可以分为鳞翅目NPV、GV、膜翅目NeseNPV与双翅目Culex nigripalpus Baculovirus四个分支。OrerSNPV lef-2与BusuSNPV在进化树上关系最为接近,而OrerSNPV lef-3和LdMNPV的最接近,OrerSNPV lef-11则和SeMNPV的关系最接近。

siRNA表达载体的构建及其表达

张建林, 邬开朗, 张 雪, 朱 应, 李 雁, 赵伟光*, 吴建国

2004, 19(5): 510

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。
Brief Reports

猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征混合感染的快速检测及地域流行性分析*

张素芳, 郑其升, 赵玉军, 陈溥言

2004, 19(5): 514

Using a pair of specific primers designed according to the relevant nucleotide sequence of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)VL2332 strain, Lv strain and Classical Swine Fever Virus(CSFV) C strain from GenBank, RT-PCR method was established to detect these two viruses at the same time. With this method, 87 tissue samples of 24 pig farms from Jiangsu, Shanghai and Fujian were tested. Among these samples 75 were PRRS positive, 56 were CSF positive, 53 were both PRRS and CSF positive, which amounts to 60.9 percent of all samples. Combined with regional epidemiology analysis, We concluded that samples from Fujian mainly mixed infected with PRRSV and CSFV, but samples from Jiansu simply infected with PRRSV.

北京地区部分人类免疫缺陷病毒基因型分析

宋爱京, 李秀华, 张春涛, 王佑春*

2004, 19(5): 517

To investigate HIV genotypes isolated from blood donors in Beijing, the samples positive for anti-HIV antibody with ELISA were confirmed by HIV blot. All 26 samples were confirmed positive for anti-HIV antibody. RNA from those samples were detected with RT-PCR. 20 of them were positive for HIV RNA. The purified PCR products were cloned. The sequences were determined and analyzed. The results showed that 10 of 20 isolates were CRF BC, 9 of them were genotype B, 1 of them were CRF AE. 6 of 9 genotype B belong to B’(Thailand B), the remaining 3 isolates may belong to western genotype B. The results indicated that several different genotypes of HIV which are predominant in China may exist in Beijing. This result may be helpful for the development of HIV vaccine in Beijing.

乙型肝炎病毒感染与肝细胞癌病例对照研究

陈冬峨, 严亚琼, 曾艳彩

2004, 19(5): 520

In order to explore the relationship between Hepatitis B virus infection(HBV) and hepatocellular carcinoma (HCC), a case-control study was conducted based on the diagnosed HCC patients in Wuhan city from January 1, 2000 to July 31, 2003. The data obtained from 313 cases and 313 controls were first analysed by means of single variable analysis and then by the multivariate Logistic regression analysis. The result showed that history of HBV infection was closely associated with HCC (OR=7.606, 95%CI 3.679-15.722). History of hepatitis is the major risk factors of HCC.

鸡痘的诊断与防治技术研究*

王雪鹏, 刘悦竹, 孙英峰, 常维山

2004, 19(5): 523

In this experiment the Fowlpox virus (FPV) antibody of two groups of chickens were tracked for 20 weeks by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). A group of chickens were artificial infected. B group were the control of healthy chickens. The results indicated that the positive antibody rate of A group reached 95% in 4 weeks. The high level antibody could last 10 weeks. After being infected again the positive antibody rate reached 100% in two weeks. The positive antibody rate of serum of some convalescent chickens infected naturally was 44%, and which of three groups from some farms that were vaccinated with pox vaccine were 60%, 70% and 10% respectively. The chickens whose antibody was proved negative changed from positive with the method were ill after they had been infected artificially. However none of the chickens whose antibody were positive suffered from the virus after they were infected artificially. In addition, the neutralization test shown the antibody of FPV might be used to treat pox disease.
Review

丙型肝炎病毒蛋白的分子生物学研究进展

王 迪, 张 雪, 杨复华, 李文鑫*

2004, 19(5): 526

人乳头瘤病毒致癌机制的研究进展*

卞继峰*, 于修平

2004, 19(5): 531

呼肠孤病毒内源性转录的结构基础*

方 勤*, 丁清泉

2004, 19(5): 535