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2005年20卷1期

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Research Article

SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达

晏辉钧, 赵卫, 方丹云, 周经姣, 龙北国, 张文炳, 郭辉玉, 江丽芳

2005, 20(1): 1

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RT PCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P. pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌用甲醇诱导表达,SDS PAGE检测其表达产物。Mut+ 酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约65kDa和42 kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的组装

王瑞青, 梁昌镛, 焦成松, 宋建华, 陈新文

2005, 20(1): 5

根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV) SA14 14 2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列, 设计一对特异性引物, 用PCR方法扩增编码JEV囊膜蛋白主要抗原域基因, 其中含ha基因主要核苷酸序列。将PCR产物定向克隆入原核表达载体pET 32a(+), 构建原核表达载体pET EHA。阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌, 经IPTG诱导获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验。结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点, 是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法。

日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用

郑其升, 杨耀武, 张晓勇, 周斌, 曹瑞兵, 李鹏, 陈德胜, 陈溥言

2005, 20(1): 11

根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV) SA14 14 2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列, 设计一对特异性引物, 用PCR方法扩增编码JEV囊膜蛋白主要抗原域基因, 其中含ha基因主要核苷酸序列。将PCR产物定向克隆入原核表达载体pET 32a(+), 构建原核表达载体pET EHA。阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌, 经IPTG诱导获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验。结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点, 是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法。

IL-12基因对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

王福祥, 孙永涛, 刘娟, 马英骥, 杨宝山, 颜丙柱

2005, 20(1): 16

研究白细胞介素12(IL 12)基因对HIV 1核酸疫苗诱导免疫应答的影响,以探求治疗性HIV 1 核酸疫苗的新策略。将pCI neoGAG联合白细胞介素12基因或者pCI neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN γ,通过MTT实验检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验,通过乳酸脱氢酶(LDH)实验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。与pCI neoGAG免疫组比较,pCI neoGAG联合白细胞介素12基因免疫组小鼠血清的抗HIV 1p24 抗体滴度降低,有显著性差异(P 0. 01);而与pCI neoGAG 免疫组比较, pCI neoGAG联合白细胞介素12基因免疫组小鼠血清的IFN γ升高,有显著性差异(P0.01);pCI neoGAG联合白细胞介素12基因免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI neoGAG免疫组,有显著性差异(P0.01)。因此,白细胞介素12基因基因联合HIV 1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素12基因对体液免疫有抑制作用。

人多瘤病毒BK株VP1的C端阳电荷残基对病毒样颗粒形成的影响

柯昌文, 李天成, 武田直和

2005, 20(1): 20

VP1是人多瘤病毒BK株的主要结构蛋白,使用重组杆状病毒表达系统在体外表达VP1 可以形成病毒样颗粒(VLP)。为了探讨VP1的C末端阳电荷残基R 281, R 285, K 288, R 290, R 292, K 293, R 294,和K297 对VLP形成和其结合DNA的影响,我们分别改变将阳电荷残基变成丙氨酸,然后表达VP1 蛋白。结果发现用丙氨酸替代K 288,R 290,R 292,K 293,R 294后仍能形成VLP, 但与野毒株相比,在VLP分泌以及衣壳蛋白与细胞DNA的结合方面有差异。有趣的是,R 281被丙氨酸取代后仅在细胞中形成少量的VLP,而R 285 被丙氨酸取代后不能形成VLP。该研究证实阳电荷氨基酸残基R 281 和R 285 是形成VLP所必须的,K 288、R 290、R 292、K 293、R 294和K 297则影响VLP和DNA的结合。

增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用

郑兰艳, 于月新, 张姝娜, 牟玲, 罗恩杰

2005, 20(1): 24

以往的研究表明非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定结构是一种很有希望的候选疫苗佐剂。为了研究增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用,在本实验中,将重组真核表达质粒pcDNA3.1+S(ISS)直接肌注免疫BALB/c 小鼠,分别用ELISA法检测血清特异性抗体的变化,MTT法检测T细胞增殖反应,以及用ELISA kit检测免疫鼠脾细胞上清液中细胞因子IL 4和IFN γ的动态变化,从而了解免疫鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应。结果显示pcDNA3.1+S(ISS)接种组的小鼠血清抗体水平、T细胞增殖反应以及细胞因子IFN γ的产生水平较对照组pcDNA3.1+S和空载体pcDNA3.1+接种组的要高。而细胞因子IL 4 较对照组却无明显变化。由此可见,增加CpG基元的质粒能够增强其所诱导的免疫反应,可用于那些需要借助强有力细胞免疫来清除病原体的疫苗研制中。

鹅细小病毒分离株HG5/82的分子特征分析

孔宪刚, 李桂霞, 刘胜旺, 冉多良

2005, 20(1): 28

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段。将该片段分别进行克隆及序列测定,并与GPV 国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应序列比较。结果表明:HG5/82 株非结构蛋白(Non structure, NS)基因长为1884bp,编码627个氨基酸。HG5/82株结构蛋白基因长为2199bp,编码732个氨基酸。序列分析结果表明,我国地方分离株与国内外鹅细小病毒相比,ns基因、vp基因均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征。为进一步研究GPV的基因功能、遗传变化规律及病毒分子致病机理提供了一定的分子基础。结构基因VP3 间变异较小,这是目前GPV只有一个血清型的分子基础,为基因工程苗的研制提供了可行性。HG5/82 与番鸭细小病毒相应序列比较发现,与细小病毒其它成员相比两者具有较近的亲源关系,但这种同源性明显低于鹅细小病毒之间的同源性。

一氧化氮对猪细小病毒体外增殖的影响研究

魏战勇, 崔保安, 黄克和, 王学斌, 金喜新, 张龙现

2005, 20(1): 33

本文研究了来源于不同前体物的一氧化氮(Nitro oxide, NO)对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)体外增殖的影响。结果表明,NO前体物S 硝基N 乙酰青霉胺(SNAP)、L 精氨酸(L Arg)均能够有效地诱导PK 15 细胞产生NO,进而显著地抑制PPV在PK 15 细胞上的复制,其效果与前体物的浓度呈正相关,在浓度为100μmol/L和200μmol/L时,SNAP产生NO的能力与抑制病毒复制的作用要强于L Arg。在病毒感染前6 h和3 h添加SNAP或L Arg对病毒复制的抑制作用比在病毒感染后3 h 和6 h添加的作用强,表明NO的抗病毒作用主要发生在病毒感染的初始阶段。此外,添加具有抑制L Arg产生NO作用的N 硝基L 精氨酸(L NNA)能抵消L Arg体外抗病毒的作用。

牛免疫缺陷病毒基质蛋白和衣壳蛋白的可溶性表达

朱义鑫, 张晓光, 杨怡姝, 刘畅, 乔文涛, 陈启民, 耿运琪

2005, 20(1): 37

基质蛋白和衣壳蛋白是BIV的主要结构蛋白,在病毒感染及整个复制周期中起重要作用。本文采用pTXB系统在大肠杆菌中表达出融合状态的牛免疫缺陷病毒BIV基质蛋白MA及衣壳蛋白CA,经几丁质亲合、自剪切纯化后,获得不含融合片段的纯化产物。每克湿菌体MA产量可达毫克级,CA表达量达十毫克级。用原核表达获得的高纯度CA蛋白免疫大白兔获得的抗血清,经Western Blot 分析显示能够与病毒颗粒的CA蛋白发生特异反应,证实表达产物具有良好的免疫原性和反应原性,可用于制备相应抗体,为研究BIV相应基因表达变化,进行体外蛋白质相互作用试验提供工具。

用套式PCR方法检出腹泻及健康犬粪中的犬冠状病毒

王玉燕, 陆承平, 温海

2005, 20(1): 41

自2003年夏至2004年初的8个月内收集犬粪样112份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪便43份,某养犬场群养健康犬粪便30份,沈阳地区某养犬基地群养健康犬粪便39 份,用套式PCR方法检测犬冠状病毒(CCV)。结果显示,南京家庭单养腹泻病犬CCV阳性率为40.9%(18/43),CCV检出率与季节相关,冬季的检出率较高。健康犬阳性率为84.1%(58/69),其中沈阳某场健康犬CCV的感染率(87.2%)高于南京某犬场(80.0%)。取南京腹泻犬和沈阳健康犬阳性样本各2份测序,结果表明,4个样本M基因212bp的序列与GenBank登录的中国大熊猫源的CCV同源性最高(94.8~96.7),并且南京和沈阳CCV毒株之间存在一定序列差异。所有阳性样本用CCV基因型鉴别PCR鉴定,均为CCVⅡ型。

我国一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与初步分析

寇铮, 李天宪, 钟靖, 陈绳亮, 范兆军, 张忠

2005, 20(1): 46

采用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养增殖首次从湖北省云梦县分离的鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling dis ease virus,BFDV)分离株(BFDV HBYM02),经PCR分段扩增法获得全基因组并完成序列测定。HBYM02 株全序列测定结果与GenBank中仅有的六株BFDV全序列进行同源性与进化分析。经BLAST分析,HBYM02株与其他六株BFDV同源性为98%~99%,为同一个基因型。运用Phylip3.5软件构建进化树,分析显示,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性。

传染性法氏囊病不同代次细胞毒免疫效果的研究

崔言顺, 李建亮, 孙淑红, 杨萍萍, 姜世金, 崔治中, 张彦明

2005, 20(1): 50

将从山东省东营分离到的1株传染性法氏囊病病毒(IBDV)野毒(暂命名IBDV SDDY株,经鉴定该株与IB DV STC株具有较高的同源性)经SPF 鸡胚传代,然后转为细胞培养,取第20 代、21 代、25 代毒,以1 倍剂量(3000TCID50/0.2mL )和5倍剂量不同的免疫剂量,分别在7日龄、14日龄对商品代海蓝褐蛋鸡进行免疫,并于免疫前用IBD ELISA试剂盒检测IBDV母源抗体水平,于35 日龄用传染性法氏囊病病毒超强毒(very virulent In fectious Bursal Disease Virus, vvIBDV )GX 8/99攻毒,在攻毒前再次检测IBDV的抗体水平,攻毒后观察记录各分组鸡的致病率和死亡率,并计算免疫器官体重指数,观察免疫器官的组织损伤情况。试验结果表明:3 代毒都具有较高免疫原性,但是20代毒仍具有较大的毒性,7 日龄接种会引起法氏囊的萎缩,造成持续的组织损伤;21 代毒、25代毒保护率高,无免疫抑制,是比较理想的疫苗来源;7日龄免疫较14日龄免疫更易造成组织损伤和免疫抑制,14日龄免疫较为合适。

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

沈弢, 张晓燕, 童骁, 范秀娟, 梁华, 马燕, 相文华, 沈荣显, 邵一鸣

2005, 20(1): 55

在已有全长基因组感染性克隆pLGFD3 8的基础上,按照疫苗制作过程中EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加env 突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和RT PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

宋岩, 师东方, 樊琛, 刘胜旺, 魏华, 李一经

2005, 20(1): 61

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1 756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得vp4 基因的表达,对表达的VP4 蛋白进行Western blot分析和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株CRW 8 株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明JL94株与CRW 8 株属同一VP4 血清型,而与Gottfried株属不同血清型。JL94 株VP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于aa81 aa207。vp4 基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性。所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断JL94 在MA104 细胞上引起的细胞病变。

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

独军政, 常惠芸*, 丛国正, 林彤, 邵军军, 付生芳, 刘在新, 谢庆阁*

2005, 20(1): 65

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长2199 个碱基,编码733 个氨基酸,该基因与Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的p1 基因核苷酸序列同源性分别为88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与Ind63/72、Pka3/54、Israel株的vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在42-50 位和137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达90%以上,本实验为进一步研究A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。

消杀型纳米催化剂抗病毒作用的研究

桂芳, 张卓然, 郑丛龙, 周大勇, 李岩, 杨淑凤, 许国旺, 明平文, 刘中和, 杨凌

2005, 20(1): 70

本文探讨112种消杀型纳米催化剂吸附与灭活病毒的功效,为开发新型抗病毒纳米材料提供理论依据。我们将各种纳米催化剂与副流感病毒、人疱疹病毒Ⅰ型、腺病毒1型及5型作用一定时间后,分别以血凝试验及观察CPE变化的方法判断纳米材料对各种病毒的吸附与灭活作用,并在电子显微镜下观察纳米材料对病毒的吸附情况。结果在所检测的112种纳米催化剂中,用血凝试验分别筛选出强吸附力催化剂29 种、中吸附力催化剂36 种、弱吸附力催化剂47种。其中,13 种强吸附力催化剂对副流感病毒的吸附率在87.5%~93.75%之间,并以AB 24的抗病毒效果最好。

大肠杆菌O157噬菌体中vt2基因A、B亚单位的克隆与序列分析

张慧英, 孙建和, 严亚贤*

2005, 20(1): 75

根据GenBank中毒素基因vt1、vt2序列设计合成4 对引物,以大肠杆菌O157 菌株DNA为模板,扩增vt1、vt2,从只含有vt2的菌株中诱导释放噬菌体,以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,获得vt2、vt2 A、vt2 B 3条特异性DNA带;将vt2 A、vt2 B扩增产物纯化后,分别插入pMD18 T载体,测序结果与相应序列比较,vt2 A和vt2 B亚单位的基因序列与GenBank中编码VT2 毒素的A、B亚单位的核苷酸序列(X07865,NC_002655, BA000007,AF291819)的同源性分别为98%~99%、96%~100%,确定vt2 位于噬菌体,并为进一步研究大肠杆菌O157 中VT噬菌体的毒力转导、VT2毒素的表达和应用奠定基础。

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

王舒, 王华林, 邓菲, 吴东, 龙钢, 袁丽, 胡志红

2005, 20(1): 79

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白, 组I类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64, 而组II类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F。本文以组II类型的HaSNPV为研究对象, 研究组I类病毒的GP64能否在组II类病毒中正确表达和包装。利用Bac to Bac系统, 构建了带有AcMNPV膜融合蛋白GP64 和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64+ egfp+, 同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒HaSNPVegfp+, 通过对HaSNPVgp64+egfp+感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测, 证明GP64可在HzAM1中表达, 并被包装入子代BV。
Brief Reports

禽流感病毒HA部分基因的克隆及其表达

陈全姣, 金梅林*, 陈焕春

2005, 20(1): 84

The gene fragment of Avian influenza virus (AIV) was amplified by RT-PCR. The results of sequence analysis showed that high homology(97%) exists among duck, goose and Human influenza virus in Hongkong AIV in 1997, indicating that there are close relationship among these ha genes. The ha gene are expressed efficiently in E.Coli.

一株长春地区戊型肝炎病毒全基因cDNA序列测定

刘子玲*, 迟宝荣, 刘金香

2005, 20(1): 84

Through analyzing the whole cDNA sequence of the sporadic Hepatitis E virus gene and comparing it with other genotypes,we can understand its variability.We used RT-nPCR to assay the HEV RNA of a patient who was diagnosed with sporadic hepatitis E virus. We designed the primers according to different segments respectively to amplify the whole gene,and sequenced the product . The whole cDNA of HEV contains 7139bp,which consisits of 5’-UTR(nt 1-9),ORF1(nt 10-5130,1706aa),ORF2(nt 5127-7151,674aa),ORF3(nt 5155-5499,114aa),and 3’-UTR(nt 7152-7193). The identity of nucleic acid between it and genotypeI, genotypeII, genotypeIII, genotypeIV is 73.2%~74.1%,72.4%,73.95%~75.2% and 83.9%~85.6%,respectively. Analyzing the phylogenetic tree showed that it is relevant to HEV genotypeIV line. Sporadic hepatitis E virus in Changchun is HEV IV,and it has higher heterogeneity.

II型猪圆环病毒检测试剂盒的研制

姜焱, 侯玉峰, 王凯民, 张常印

2005, 20(1): 89

猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属圆环病毒科圆环病毒属成员[1]。PCV分两种血清型,即PCV 1 和 PCV 2,其中 PCV 1 由 Tischer 等[2] 于1974年检测到,对猪没有致病性;PCV 2 可引起部分断奶仔猪和育肥猪的断奶仔猪多系统综合征( postweaning multisystemic wasting sy...

伪狂犬病毒立即早期基因5′端特异性反义RNA对病毒增殖的影响

方六荣, 肖少波, 余晓岚, 徐建祥, 陈焕春*

2005, 20(1): 89

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属疱疹病毒科α 疱疹病毒亚科,基因组为线状双链 DNA,长约150kb,至少可编码 70~100 种蛋白质。根据伪狂犬病毒感染细胞后 DNA 转录、表达时间的先后可将PRV基因分为立即早期基因(Immediate-early gene),早期基因 (Early gene)和晚期基因...