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2006年21卷1期

Contents

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

严菊英, 卢亦愚, 张健华, 冯燕, 史雯, 茅海燕, 龚黎明, 葛琼, 周敏, 李敏红

2006, 21(1): 1

为了研究浙江省1999~2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响。我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定。结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999~2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%~100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%~95.7%和95.9%~96.3%。从基因进化树显示,1999~2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异。

Hsp70与汉滩病毒S基因融合蛋白的原核表达及免疫小鼠的初步研究

李静, 叶正旭, 杨守京,

2006, 21(1): 11

本文构建了hsp70与S基因的原核融合表达载体pGEX-4T-1/hsp70-S;在大肠杆菌中表达;并通过GSTrapFF柱进行了纯化。同时制备了NP和Hsp70两种纯化蛋白。分别用这三种纯化蛋白免疫BALB/c小鼠;结果表明纯化的NP和Hsp70-NP两种蛋白均可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)抗体;且后者刺激产生的抗体效价明显高于前者。淋巴细胞增殖实验表明;两组免疫小鼠的脾细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应;而Hsp70-NP组免疫小鼠脾细胞对NP的增殖指数明显高于NP组免疫组。结果显示;与单独用NP免疫小鼠相比;Hsp70-NP纯化蛋白可以刺激机体产生更强的抗汉滩病毒体液免疫应答和特异性淋巴细胞增殖反应。
Research Article

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D在酵母中的表达

李智华, 徐维明, 姬秋彦, 龙海亭, 彭正华, 李健峰

2006, 21(1): 6

从提取的HSV-1基因组中扩增得到编码gD蛋白胞外区1~314aa的基因gDt,将其插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建携带gDt的重组载体,经电转化GS115菌株和G418筛选,得到了高效分泌表达gD蛋白的毕赤酵母菌株,表达量达到250mg/L,该目的蛋白可被gD单抗(1-I-9)特异性识别。表达产物经离子交换、金属螯合、分子筛柱层析纯化后得到纯度较高的重组蛋白。重组gD蛋白免疫BALB/c小鼠可诱生一定水平的特异性抗体,表明该蛋白具有较好的免疫原性,能够诱导小鼠产生体液免疫应答。

EB病毒潜伏性膜蛋白1促原代MEF细胞永生化的作用及机制

贺智敏, 张志伟, 杨芳,

2006, 21(1): 16

为了探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)促原代小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞增殖规律及作用机制;构建包含野生型LMP1和其TNFR相关死亡区(TRADD)结合区即羧基末端384~386氨基酸置换(YYD→ID)的突变型LMP1逆转录病毒;感染原代培养的MEF细胞;动态观察各细胞在传代培养过程中细胞动力学和形态学变化。发现对照细胞(MEF-LNSX)传至P8~P10时出现明显的生长阻滞;携突变型LMP1的细胞(MEF-LMP1TRADD)自P10起倍增时间逐渐延长; P19时出现明显生长阻滞;而携野生型LMP的细胞(MEF-LMP1)倍增时间逐渐降低并发生了永生化。Western blot检测发现MEF-LNSX细胞CyclinA表达自P4起明显降低;MEF-LMP1TRADD细胞自P10显著增高后快速降低;MEF-LMP1自P10显著增高后一直维持在较高水平。结果表明:LMP1能促进MEF细胞增殖并诱导体外永生;LMPTRADD则仅能诱导MEF细胞的早期增殖。提示羧基末端区(TRADD)是LMP1促MEF细胞永生的重要活性部位;上调CyclinA表达可能是其作用机制之一。

SSH技术筛选β干扰素真核表达载体转染细胞的下调基因

钟彦伟, 成军, 曲建慧,

2006, 21(1): 21

筛选β-干扰素质粒转染下调相关基因。以β-干扰素表达质粒pcDNA3.1(-)-IFNβ转染HepG2细胞;同时以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液;从中提取mRNA并合成cDNA;经RsaI酶切后将来自pcDNA3.1(-)转染的cDNA分成两组;分别与两种不同的接头adaptor 1和adaptor 2衔接;再与来自pcDNA3.1(-)-IFNβ转染的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR;将产物与T/A载体连接;构建cDNA消减文库;并转染大肠杆菌进行文库扩增;随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。成功构建人β-干扰素质粒转染下调相关基因差异表达的cDNA。所获得的50个克隆中;随机挑选37个克隆均含有插入片段;将这些克隆进行序列测定;并通过生物信息学分析获得其全长基因序列;结果共获得22种编码基因;其中3种为未知功能的基因。筛选到的cDNA序列;包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因。

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

龚育平, 高军, 赵平, 秦照玲, 杨苗, 戚中田

2006, 21(1): 24

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCV HVR1模拟表位融合蛋白。用Western blot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应。结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35)。融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCV HVR1合成肽发生交叉反应。本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值。

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

王先炜, 姜平, 李玉峰

2006, 21(1): 29

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Western blot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。

网状内皮增生病病毒感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

孙淑红, 崔治中, 邱玉玉

2006, 21(1): 34

我国鸡群中网状内皮增生病病毒(REV)感染已相当普遍,但对其造成的实际危害却不太清楚。本研究结果表明,1日龄SPF鸡感染REV会显著抑制对新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗的免疫反应。1周龄用相应灭活疫苗免疫后3周、4周和5周,REV感染组对不同病毒疫苗免疫后的HI效价显著低于对照组。高剂量REV感染组的抑制作用大于低剂量感染组,但统计学差异不显著。REV感染可造成中枢免疫器官萎缩,REV感染组的胸腺、法氏囊与体重比显著低于对照组。本研究证明了,REV早期感染会干扰鸡群对NDV、AIV的免疫效果,特别是会严重干扰对AIV疫苗的免疫效果。

ICAM-1及其受体在高致病性禽流感病毒性肺炎中的作用研究

赵宏霞, 夏咸柱, 鲁继荣, 岳玉环, 杨松涛, 朱平

2006, 21(1): 38

本文应用高致病性禽流感病毒性肺炎(Highly pathogenic avian influenza viral pneumonia, HPAIVP)小鼠模型,采用免疫组织化学染色方法,对实验组和对照组小鼠肺组织中ICAM-1及其受体的表达含量进行检测。研究发现:实验组小鼠肺组织中ICAM-1及其受体表达含量在攻毒后1d即开始升高,第4天达高峰。就攻毒剂量来说,以100LD50/50 L攻毒组小鼠肺组织中ICAM-1及其受体阳性表达量升高最明显。并通过ELASA方法进一步证实了这种变化。结果表明:ICAM-1及其受体在HPAIVP中呈现高表达,可能在其发病中发挥了重要作用。

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达

宋建领, 张富强*, 王金萍, 胡媛媛

2006, 21(1): 43

根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物。自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTM DNA Polymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTM pET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa。分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明:重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。关键词:禽流感病毒;H5N1亚型;神经氨酸酶;表达

HaSNPV的9个基因的转录谱分析

代文涛, 邓菲, 王华林, 袁丽, 胡志红

2006, 21(1): 47

使用反转录和实时荧光定量PCR技术,我们对HaSNPV的几个预期的早期基因、早晚期基因、晚期基因、极晚期基因的转录时相进行分析,结果表明:这些基因的起始转录时间与其自身的启动子类型基本是一致的。但是预期的早期基因pkip晚期才开始转录;预期的早晚期基因ha107早期不转录,仅在晚期转录。这些基因的转录水平一般都在病毒感染细胞72 h后达到最高,并且极晚期基因polyhedrin的转录水平明显高于其它基因。Iap2的转录水平仅次于polyhedrin,表明它可能是一个功能基因。与AcMNPV的p10不同,在HaSNPV/HzAM1系统中p10的转录水平并不高。

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

李斗林, 李艳秋, 张珈敏, 杨波, 陈伍国, 周伟东, 胡远扬*

2006, 21(1): 52

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV) 多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBAC HTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBAC S10,重组穿梭质粒Bacmid S10,重组杆状病毒Ac S10。多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测。结果表明:S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核。

SpltMNPV日本分离株gp41的克隆表达及gp41和ph的进化分析

胡兆丽, 朱江, 盛晔, 王文兵, 李新平, 沈颂东

2006, 21(1): 57

从斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)日本分离株(C3)基因组中克隆了gp41基因。该基因编码区含993bp核苷酸,编码分子量为36.9kDa的多肽。将该基因克隆至原核表达载体pET28a,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达。应用CLUSTAL程序分析表明,SpltMNPV日本株(C3) gp41的核苷酸序列和氨基酸序列与SpltMNPV中国G2株相似性最高,均达99.9%。用MEGA分别构建了基于gp41和 ph的聚类分析图和分子进化树,发现它们具有相似的拓扑结构。将这两个基因序列结合在一起构建进化树,该树的结构与基于gp41的进化树相似。突变率分析显示gp41的突变率高于ph,这意味着在杆状病毒进化过程中,gp41和ph面临不同的选择压力。

齿兰环斑病毒的鉴定及其抗血清的制备与应用

明艳林*, 郑国华, 李梅

2006, 21(1): 64

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)。通过摩擦接种6科27种(或品种)指示植物,结果其中4科8种(或品种)表现症状,与烟草花叶病毒不同;理化性质试验表明稀释限点为5×10-5,致死温度为92℃~94℃,体外存活期超过3个月。提纯病毒为长约300nm,宽约18nm杆状粒体。SDS-PAGE电泳分析表明其外壳蛋白分子量约为17kDa。该分离物与ORSV抗血清具有强阳性反应、而与TMV抗血清反应微弱,认为该病毒为ORSV分离物。用纯化病毒免疫家兔,成功地制备出特异性抗血清,并通过Dot-ELISA法对厦门地区种植的兰花病株进行了检测研究。
Brief Reports

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LDL97Ⅰ/97株S基因特征

刘昕, 刘胜旺, 孔宪刚, 张庆霞, 荣骏弓, 韩宗玺, 邵昱昊

2006, 21(1): 68

The spike gene (S) of Infectious bronchitis virus (IBV) CK/CH/LDL97Ⅰ/97 isolate was amplified,cloned, sequenced and analyzed. Results showed that the S gene was 3501 bp encoding a polypeptide of 1167 amino acids. The precursor of the S protein was cleaved into S1 and S2 fragments, which comprised 541 and 626 amino acid residues, respectively. The cleavage site sequence was RRTGR. The homologies of nucleotide and amino acid sequences of S1 gene between CK/CH/LDL97Ⅰ/97 and 27 reference IBV strains ranged from 60.6% to 99.6%, and 50.5% to 99.1%, respectively. The CK/CH/LDL97Ⅰ/97 S1 was most similar to that of three proventriculus IBV isolates, Q1(99.1%), J2(98.9%), T3 (98.9%), which were isolated in China. Phylogenetic analysis of S1 proteins indicated that CK/CH/LDL97Ⅰ/97, Q1, J2 and T3 formed a separated cluster, which might belong to a novel genotype of IBV.

表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

邱亚峰, 葛菲菲, 张雪莲, 徐学清, 陈溥言*

2006, 21(1): 71

The LacZ gene controlled under the Marek’s disease virus (MDV) glycoprotein B (gB) promoter was excised from plasmid pSK-gB-LacZ and inserted into US10 gene. Two plasmids were constructed, pUS-gB-LacZ(L)and pUS-gB-LacZ(U)),which differ with regard to the orientation of the expression cassette. Then pUS-gB-LacZ(L)was transfected into secondary Chicken embryo fibroblasts (secondary CEF) cells and super-infected with the MDV CVI988 strain. The recombinant virus (rCVILacZ) expressing the lacZ gene was isolated and purified in secondary CEF. The growth curve of rCVILacZ was similar to that of the parent virus in CEF.

猪瘟病毒结构蛋白Erns在E.coli中的高效表达及纯化

尹双辉, 刘湘涛*, 韩雪清, 尚佑军, 孙士琪

2006, 21(1): 75

The Erns gene was amplified by RT-nPCR from C-strain of Classical swine fever virus (CSFV). Then the Erns gene was cloned into pGEX6P-1 vector. The expression products were analysed by SDS-PAGE and Western blotting methods. The inclusion bodies were recovered from bacterial lysate by centrifugation and washed with buffer, and then dissolved in denaturing agents. The protein was refolded by dilution dialysis. Refold protein reacted strongly with the positive serum of CSFV, which indicated that the protein has immunogenic.

鸡传染性支气管炎病毒E蛋白基因的表达

周玉长, 刘胜旺*, 孔宪刚

2006, 21(1): 78

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to amplify the Small Envelope (E) gene of avian Infectious bronchitis virus (IBV) LX4 strain and the gene was cloned into the pMD18-T vector. By digestion with restriction enzymes SalⅠand BamHⅠ, the E gene was subcloned into pET-30a vector to construct recombinant plasmid pET-30a-E. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21(DE3) and induced with IPTG. It was demonstrated by SDS-PAGE that a protein of 14kDa, which was comparable in size to the native E protein, was expressed in E. coli. The 14KDa protein was purified and used to prepare the rabbit antiserum against IBV E protein. The result showed that the antibody could react with purified E protein in Western blotting.

马传染性贫血病毒美洲流行株与我国弱毒疫苗株鉴别诊断方法的研究

耿庆华, 王晓钧, 赵立平, 吕晓玲, 沈荣显, 相文华*

2006, 21(1): 81

In order to develop an assay to distinguish the infection of Equine infectious anemia virus (EIAV) American strains from Donkey-leukocyte attenuated virus (DLV) strain, eight primers were designed based on the comparison of complete sequences of four EIAV American strains and DLV. Corresponding viral genome fragments were amplified and analyzed from donkey leucocytes by PCR using these eight primers. Four primers from gag gene were selected to detect the differences between EIAV American strains and DLV. Six horses were inoculated with DLV and two with EIAV American strains, the Wyoming strain and the Argentina strain, respectively. Two fragments, 675bp and 400bp, were amplified from DLV-infected cells, while only one segment of 675bp was obtained from cells inoculated with American strains. Our results indicate that this nest multiplex PCR can be used to distinguish EIAV American strains from the donkey leucocyte-attenuated vaccine strain of EIAV.
Review

ICTV第八次报告的最新病毒分类系统

洪健, 周雪平

2006, 21(1): 84