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2006年21卷2期

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Research Article

湖北地区普通人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

方勤, 刘娟, 白志强, 康涛, 何之恒, 胡志红

2006, 21(2): 97

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)可导致人类产生卡波氏肉瘤(KS),即AIDS病人最为常见的肿瘤。广泛的流行病学研究显示,KSHV的流行与 KS相似并呈现明显的地域分布型。为调查KSHV在汉族普通人群中的感染情况,我们以KSHV ORF65编码的小衣壳蛋白(small capsid protein)为抗原,采用酶联免疫(ELISA)分析方法,对湖北地区560例汉族普通人群血清样品进行了KSHV抗体检测。在检测的560份血样中,KSHV抗体总阳性率为5.2%,其中,男性阳性率为5.7%,女性为4.5%。统计学分析显示,KSHV感染率在男女性别上无差异(P=0.542),但与年龄有一定的相关性:10岁以下儿童群体较之10岁以上人群KSHV感染率具有显著的统计学差异(P=0.006,OR=6.692,95%CI=1.710-26.198); 60岁以上的老年人群KSHV感染率有上升趋势,但无统计学明显差异(P=0.052)。上述结果表明,KSHV在这一地区的流行与西方成年人群的感染率相似,但在儿童群体中的相对较高的感染率与一些非洲地区的接近。由此提示在该群体可能存在特殊的传播模式。

HIV-1 P24抗原国家参考品的研制

许四宏, 宋爱京, 李秀华, 王佑春*

2006, 21(2): 102

收集正常人、HIV感染者和疑似感染者血浆以及HIV-1病毒培养裂解液,对其进行HIV抗体、HIV P24抗原、HCV抗体和HBsAg检测,对HIVP24抗原阳性者进行HIV RNA检测,并对部分样品进行基因分型。以NIBSCP24抗原标准品的系列稀释样品作为线性灵敏度参考品。经过实验筛选出20份阴性参考品,10份阳性参考品,10份线性灵敏度参考品,2份精密性参考品,共同组成HIV-1P24抗原国家参考品,经多家不同的试剂进行标定,制定了相应的标准。稳定性研究结果表明,反复冻融三次对该参考品的稳定性没有影响。由此,初步建立了HIV-1P24抗原国家参考品,该参考品将对HIV-1P24抗原、HIV抗体/P24抗原联合检测试剂的质量控制提供重要依据。

一种高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体的构建

倪芳, 鲁茁壮, 王立生, 瞿成奎, 汪思应

2006, 21(2): 106

人C组5型腺病毒(Ad5)载体能够有效感染上皮来源的细胞,但对造血细胞的感染效率很低,限制了其在造血调控基础研究以及血液病基因治疗中的应用。为了建立高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体系统,对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造,以AdEasy系统为基础,应用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因,采用一系列分子生物学方法将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因,得到新的腺病毒骨架质粒命名为pAdEasy-1/F11p,应用带有GFP报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得重组腺病毒,命名为Ad5F11p-GFP。以Ad5-GFP作对照,同时感染K562、U937等白血病细胞系,流式细胞仪检测GFP的表达。初步检测结果显示:在10MOI时,Ad5F11p-GFP能够有效感染K562、U937等白血病细胞系,感染细胞效率>90%,对照Ad5-GFP感染细胞效率<30%,这表明改建后的腺病毒AdEasy-1/F11p可以高效介导基因转移到血液细胞,是一种很好的血液细胞靶向性腺病毒载体。

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

茅海燕, 卢亦愚, 严菊英

2006, 21(2): 111

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3’端基因高变区核苷酸序列与RSV GA2亚型的同源性最高。提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSV GA2亚型。

应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1;HIV-2 IgG抗体

翟建新, 王业富*, 段炼炼, 徐争辉, 万志香, 杨永

2006, 21(2): 116

应用斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)建立了一种同步快速检测四种抗HIV-1/2 IgG抗体的HIV诊断试纸。通过基因工程技术在大肠杆菌中表达了5种HIV抗原蛋白片段(P24,GP41,GP36,GP120V3,GP120C)。这5种抗原蛋白首先被固定在硝酸纤维素膜上,然后滴加待测血清,其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合,再加胶体金标记的葡萄球菌蛋白A (SPA),待其渗过膜片后,洗涤,即可形成肉眼可见的红色斑点。用已确证的21份HIV阳性血清(其中包括1份HIV-1标准阳性血清和1份HIV-2标准阳性血清)和30份阴性血清进行了试验,结果表明该快速检测方法与ELISA方法无显著差异。该检测方法不需任何仪器,仅凭肉眼即可判定结果,整个检测过程不超过5分钟。与传统的的ELISA法相比,具有方便快速,成本低廉,应用范围广等优点。 同时,此HIV快速诊断试纸可以同步检测并区分针对HIV-1和HIV-2感染的不同检测标志物(抗P24、GP41、GP120和GP36抗体),这对提高快速检测的灵敏度和准确性,以及对判断HIV感染者是否临近或 已进入AIDS期有着较高的应用价值。

人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

郭丽, 周红莉, 屈建国, 王健伟, 徐樨巍, 洪涛

2006, 21(2): 121

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGII4、GGII1和GGII3等为主要的流行遗传型。为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成。以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型衣壳蛋白基因进行了表达。结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒。重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰。这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础。

HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立

王云华, 王睿睿, 杨柳萌, 李健峰, 徐维明, 郑永唐

2006, 21(2): 126

从HIV-1 IIIB 病毒RNA经RT-PCR得到HIV-1蛋白酶编码序列,克隆到pet28a 质粒中构建HIV-1蛋白酶表达载体。阳性克隆转染E. coli BL21 DE3,经IPTG诱导,蛋白酶以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白量的40%。包涵体经Triton X-100洗涤后溶解于8M尿素,溶解后的蛋白溶液经sephacyl s-200 H.R分子筛柱纯化后纯度达到90%以上,收集蛋白酶峰稀释复性并通过超滤进行浓缩。经检测,纯化的蛋白酶具有较高的活性。用荧光标记的蛋白酶底物检测不同浓度indinavir对蛋白酶活性的影响,表明该方法可以用于蛋白酶抑制剂的筛选。

广西12株狂犬病野毒株的g基因序列测定与分析

熊毅, 罗廷荣, 刘棋, 李华明, 南松剑, 郭建钢, 邓朝阳, 兰斌

2006, 21(2): 131

对广西12株狂犬病病毒株g基因全序列进行测序分析,结果显示:广西毒株属于I型,可分为3个群,即Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。GX01、GX08、GX09、GX014、GX091、GX195、GX260、GXLA 8株为Ⅰ群, GX219、GX074、GXBM 3株为Ⅱ群, GXN119株为Ⅲ群。Ⅰ群的广西毒株g基因核苷酸的同源性为97.6%~99.9%,氨基酸同源性在97.7%~100%之间;Ⅱ群的核苷酸的同源性为98.2%~99.0%,氨基酸的同源性在98.5%~99.2%之间。糖蛋白在主要的抗原位点GI、GⅡ区以及与中和抗原有关的36、263、367位氨基酸没有变异,GⅢ区上只有Ⅱ群在332位缬氨酸变异为异亮氨酸,G蛋白上的氨基酸主要在-2、-5、-13、-14、-15、-16、90、96、132、140、156、168、170、204、241、249、253、264、289、332、382、427、436、445、463、474位共26个氨基酸发生了变异,这些氨基酸的变异具有群的特异性。

褐家鼠不同脏器中汉坦病毒自然感染的差异

江佳富, 吴晓明, 左曙青, 张泮河, 郭天宇, 曹务春*

2006, 21(2): 136

为了解野外褐家鼠不同脏器中自然感染汉坦病毒状况和带毒量的差异,选取经检测鼠肺组织中HV-RNA并呈阳性的鼠个体20只,采用巢式RT-PCR检测这些个体心、肝、肺、脾和肾5种共85份脏器中的HV,对阳性标本重复扩增后直接测序,用DNASTAR软件对获得序列进行比较分析。另外,针对汉城型汉坦病毒株Z37- M片段全序列设计定量PCR特异性引物,采用SYBR Green实时定量PCR法,检测上述85份不同脏器中HV带毒量情况与相对差异。结果显示:RT-PCR对除肺脏之外的其它脏器中HV-RNA的检出率较低(11/65),不同个体肺组织来源的HV-M 片段变异较多,其中A→G碱基变异类型占1/3强。从11份除肺之外的脏器中扩增到的HV-M基因序列和其对应同一褐家鼠个体肺脏HV-M片段相比,其碱基差异不大;一肺脏来源的与该个体其他脏器来源的HV-M片段两个位点存在A→G差异,并分别导致两位置氨基酸差异。定量检测结果显示:褐家鼠不同脏器中HV-RNA检出率差异有统计学意义(χ2=16.10, P=0.003),总体阳性率大小为肺肝肾心脾;肺脏中病毒的分布比其他脏器更为普遍。带毒量也以肺脏中最高,其它脏器之间HV带毒量没有显著性差异(χ2=8.79, P=0.088)。这些结果说明:褐家鼠肺脏是HV侵犯与贮存的主要靶器官,HV基因在该器官中可能更易发生变异。这对进一步了解HV在宿主体内的贮存规律、传播及其在流行病学上的意义将有所裨益。

RNA结合域决定JDV Tat具有较强的激活能力

邓刚, 苏旸, 母俊杰, 李悦, 乔文涛, 耿运琪, 陈启民*

2006, 21(2): 142

为分析JDV与BIV、HIV-1 LTR和Tat相互激活能力差异的原因,在氨基酸序列对比及HIV-1 Tat功能域划分的基础上构建了JH、HJ、JB、BJ几种嵌合Tat蛋白,并克隆到真核表达载体。将上述表达质粒与以JDV、BIV和HIV-1 LTR为启动子,以luc为报告基因的质粒共转染Hela细胞,证实了三种不同Tat激活能力的差异主要来自其结合域RNA结合能力的差异,排除了结构域不完整和细胞因子缺乏造成JH不激活HIV-1 LTR的可能性。

猪细小病毒vp2基因的表达和类病毒颗粒的构建

司艳红, 方明刚, 王汉中

2006, 21(2): 148

利用PCR方法从病毒基因组中获得了vp2 完整的编码区并经测序后克隆到原核表达载体pET-32(a) 上。在大肠杆菌中诱导表达了VP2与Trx-His-S Tag的融合蛋白,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清。另外,将vp2克隆到pFastBacDUAL载体上,利用昆虫表达系统,即AcMNPV的Bac-to-Bac系统对vp2 进行了表达,经SDS- PAGE 和Western blot分析,表达产物为64kD,并且该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒。

蓝舌病毒HbC3株对小鼠乳腺癌MA-782细胞的感染特性

梁科, 董长垣*, 胡俊, 张蔚英, 陈杰

2006, 21(2): 153

体外研究蓝舌病毒湖北株3(BTV-HbC3)对鼠乳腺癌细胞MA782的感染性并探讨BTV-HbC3靶向性溶癌的机制。观察MA782细胞感染BTV-HbC3的病变效应(CPE);MTT法研究病毒致细胞病变率的特征;透射电镜观察感染病毒后细胞超微结构的变化;免疫组化研究病毒蛋白在细胞内的表达特点;凋亡染色(TUNEL法)观察病毒诱导细胞凋亡的情况;流式细胞仪测定病毒对MA782细胞周期的影响。结果证明BTV-HbC3感染MA782细胞后有明显的细胞病变效应;病毒蛋白主要表达在细胞的胞膜及胞浆内;凋亡染色发现大量的凋亡细胞;流式细胞仪可见明显的亚二倍体峰。故认为BTV-HbC3在体外能有效的感染MA782细胞,并能诱导MA782细胞凋亡。

鸡马立克氏病毒和网状内皮增生病毒感染肉鸡时的相互作用

庄国庆, 孙淑红, 崔治中, 曲立新

2006, 21(2): 157

为了研究鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮增生病病毒(REV)共感染时的相互作用,分别在REV母源抗体阳性(REV-Ab+)和阴性(REV-Abˉ)及经MDV疫苗CVI988株免疫和不免疫的商品代肉鸡,比较了二种病毒在病毒血症水平和特异抗体效价上的相互影响。结果表明,在未经CVI988株免疫鸡,REV病毒血症对MDV强毒接种后的病毒血症水平及抗体效价无明显影响,但REV病毒血症显著抑制了CVI988疫苗免疫为鸡提供的抵抗力和抗体效价,因而提高了强毒MDV感染后的病毒血症的程度。另一方面,MDV感染会显著减弱REV- Ab+鸡对REV感染的抵抗力,提高REV- Ab+鸡在感染REV后的病毒血症水平并抑制对它的抗体效价。分析表明,MDV和REV共感染主要通过抑制鸡体的免疫功能来影响另一种病毒的复制及其致病作用。

湖北麻鸭乙型肝炎病毒全基因组的克隆和序列分析

胡权, 雷延昌, 张振华, 田拥军, 张正茂, 李磊, 夏剑波, 陆蒙吉, 杨东亮

2006, 21(2): 163

为了解湖北地区This finding was also confirmed by the phylogenetic tree analysis. 麻鸭中鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV)自然感染状况以及湖北麻鸭所携带DHBV的基因结构特征,采集了70份成年麻鸭血清并应用PCR技术检测DHBV DNA, 对其中一份DHBV DNA阳性血清进行DHBV全基因扩增,并进行克隆与序列测定分析。结果表明,湖北麻鸭DHBV自然携带率为10%;湖北DHBV分离株(GenBank 登录号 DQ276978)基因组的全长为3024bp,有编码P,S和C蛋白的三个开放阅读框;与GenBank中17株DHBV基因组比较,核苷酸同源性介于89.85%~93.29%之间;S蛋白、C蛋白和P蛋白结构功能区序列均高度保守;而对P蛋白标志性氨基酸和全基因进化树的分析表明,该分离株属于DHBV中国基因型中的一个亚型。

MDV-1 VP22 羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

陈鸿军, 宋翠萍, 秦爱建, 刘岳龙, 金文杰

2006, 21(2): 169

VP22是血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分。本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区。SDS-PAGE电泳发现,VP22 C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右。将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22 C端抗体。通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDV CEF所有细胞核中呈特异性表达。这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用。

鸭细小病毒04Nb株的分离鉴定与rep基因测序与分析

张彦鹏, 李静, 寇铮, 陈绳亮, 范兆军, 张忠, 李天宪*

2006, 21(2): 173

采集浙江宁波地区以腹泻、呼吸困难为主要症状的病鸭肝组织,接种正常鸭胚尿囊腔增殖病毒。雏鸭感染试验显示发病症状及病理变化明显,死亡率为75%。电镜下可见纯化病毒直径约20nm左右的球形病毒粒子。免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duck parvovirus DPV)标准株阳性血清有明显沉淀线。经SDS-PAGE呈现3条结构蛋白带,与DPV标准株一致;参照GenBank DPV非结构蛋白基因序列设计引物,PCR扩增反应获得目的条带,克隆测序后,与DPV代表株序列同源性达98%。根据上述实验结果,确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV。为进一步研究该分离株rep基因的序列特征,对其rep基因克隆测序,与GenBank中两株DPV、两株鹅细小病毒(GPV)进行序列比对,结果显示rep基因核苷酸序列与DPV参考毒株同源性为98%以上,与GPV同源性为 80%左右。

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白 VP28的表达及其抗病毒感染作用

龙燕, 徐进平, 王健, 鲁伟, 刘志毅, 刘瑶, 孟小林*

2006, 21(2): 178

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pET22b-vp28并转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌株37℃IPTG诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小32kDa相符合的目的蛋白。用Ni2+-柱纯化的目的蛋白分别直接注射螯虾和包被饲料投喂螯虾,实验结果表明vp28在大肠杆菌中的表达产物有显著提高虾体抗WSSV感染力的作用, 而且注射效果更好。

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

俞海洋, 张珈敏, 杨波, 蒋洪, 周亮, 卢杰, 陈伍国, 李斗林, 胡远扬*

2006, 21(2): 181

通过RT-PCR 扩增获得PfDNV 结构蛋白基因VP1 含磷脂酶A2(PL A2)功能区片段,将其连接到pMD18-T 载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a 和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA 和 pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG 诱导, SDS-PAGE 显示得到了目的融合蛋白, 以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA 亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了western blot 鉴定 ,结果表明成功表达 PfDNV 结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。
Review

慢性肝炎中乙型和丙型病毒混合感染的重症化研究

谢立, 李秀惠, 张瑞云, 辛咏梅, 时红波

2006, 21(2): 186

To understand the dual infection by Hepatitis B virus (HBV) and Hepatitis C virus (HCV), and the viral interference between HBV and HCV infections, biochemical and virological markers of 196 patients were detected. Among 196 patients tested, 76 patients were only infected by HBV, 72 patients were only infected by HCV, and 48 patients were co-infected by HBV and HCV. There were no striking association of ALT in patients with HBV, HCV or co-infection. The positive rate of HBsAg and HBV DNA in patients with co-infection was obviously lower than that of HBV infection only. These results suggested that disease was more severe in patients with co-infection, prevalence of LC and HCC in patients with co-infection was higher than either infection alone. HBV and HCV inhibit the replication with each other, but HCV seems to suppress HBV replication more evidently. Key words:Hepatitis B virus(HBV); Hepatitis C virus(HCV); Co-infection
Brief Reports

病毒受体的研究方法

丁天兵*, 任君萍, 马文煜

2006, 21(2): 189

兔病毒性出血症病毒基因组结构与功能研究进展

刘光清, 云涛, 倪征, 张玉颖

2006, 21(2): 194

杆状病毒生态学研究进展

孙修炼*, 胡志红, 彭辉银

2006, 21(2): 200