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2006年21卷4期

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Research Article

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

徐可树, 李琪, 王华枫, 周霞

2006, 21(4): 309

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒。利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较。preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸)。对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同。认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关。

SARS-CoV N蛋白抗原表位的筛选和鉴定

黄欣, 高亚萍, 王希良, 辛忠涛, 董洁, 邵宁生, 柳川

2006, 21(4): 314

利用噬菌体展示的线性12肽库从马抗SARS-CoV IgG筛选SARS-CoV的抗原表位。经生物淘洗富集的噬菌体克隆被测序。获得两个共有序列:DXXDP和TXTLL。它们分别与SARS-CoV N蛋白341-345和392-396位氨基酸序列高度同源。含共有序列的克隆在ELISA竞争抑制试验中与SARS-CoV N蛋白竞争结合马抗SARS-CoV IgG。将两个共有序列肽通过基因重组技术成功展示到大肠杆菌鞭毛,获得重组菌F1和F2。用重组菌F1和F2免疫接种试验Balb/c小鼠产生的血清均能与SARS-CoV N蛋白特异结合。说明DXXDP和TXTLL是SARS-CoV N蛋白的两个连续抗原表位。

SARS冠状病毒N蛋白激活hfgl2凝血酶原酶基因的研究

姚华宁, 王战会, 韩梅芳, 侯金林, 罗小平, 宁琴

2006, 21(4): 319

研究鉴定激活hfgl2凝血酶原酶基因的SARS冠状病毒结构蛋白。从SARS尸检肺组织中抽提RNA后制备cDNA,分别扩增SARS-CoV的N、S2和M全长基因序列,再分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上。应用免疫组织化学分析鉴定pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-M 和 pcDNA3.1-S2的表达。构建人纤维介素(hfgl2)启动子荧光素酶报告基因质粒,并将SARS冠状病毒结构蛋白表达质粒分别与其共转染以明确激活hfgl2基因转录的SARS冠状病毒结构蛋白。将目的片段克隆至pcDNA3.1(+),经酶切鉴定和测序鉴定无误;免疫组织化学染色可见明显的CHO细胞胞浆棕染。与hfgl2启动子共转染实验阐明SARS冠状病毒膜(M)蛋白和刺突糖(S2)蛋白对hfgl2基因的激活与对照组无显著差异,而SARS冠状病毒核心(N)蛋白可激活hfgl2启动子,使其转染活性提高4.6倍。SARS冠状病毒N蛋白可增强hfgl2基因的转录活性。

新分离呼吸道肠道病毒生物学特性和S4片段的序列测定

朱虹, 苏裕心, 宋立华, 何君, 黄如统, 貌盼勇, 端青

2006, 21(4): 324

新分离呼吸道肠道病毒(简称呼肠病毒)经过空斑分纯后进行生物学和部分基因序列的鉴定。首先通过BYD株(由端青从北京于某患者标本中分离到的第一株呼肠病毒)对4种传代细胞的敏感性试验,选出L929和LLC-MK2敏感细胞,然后用LLC-MK2细胞进行理化性质试验,血凝试验和形态学鉴定。结果显示该病毒为耐乙醚、不耐酸、不耐热的RNA病毒;对人O型红细胞能产生凝集,滴度达1:32;电镜下可查见细胞胞浆内有球形、直径为70nm~80nm、双层衣壳的病毒颗粒。提取BYD株RNA并进行S4片段序列分析,结果显示该片段的氨基酸序列与已知呼肠病毒1~3型标准株的同源性分别为95%、90% 和95%。以上这些生物学以及S4片断的序列分析结果表明:新分离BYD株病毒符合呼肠病毒科的特性。

利用HSV1 α-基因启动子构建真核表达载体phIE

寸韡, 刘龙丁, 张莹, 罗杰, 吴文娟, 张雪梅, 廖芸, 李琦涵*

2006, 21(4): 328

以pcDNA3质粒为骨架,构建由1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus I, HSVI)立即早期基因启动子指导外源蛋白转录的phIE真核表达载体,该质粒为外源蛋白的表达提供了更为广泛的选择,通过插入us1编码序列,phIE-Us1被用于分析ICP22蛋白在病毒感染早期的功能;在多克隆位点插入氯霉素乙酰转移酶编码基因构建phIE-CAT检测载体,应用于检测HSVI病毒蛋白Vp16及ICP22的功能,明确显示该质粒对于研究单纯疱疹病毒的基因转录调控具有重要的应用价值。

苏南地区1b型丙型肝炎病毒包膜区变异进化研究

许可, 蒋春梅, 邓小昭, 丁伟良, 谈永飞, 张云

2006, 21(4): 333

本研究旨在了解本地区丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)基因型构成的前提下,分析1b型丙型肝炎病毒包膜2(second envelope glycoprotein E2)区的变异和种系进化,并研究其准种变异与临床肝病活动度的关系。对宜兴市人民医院收集的抗HCV抗体阳性患者166名,RT-PCR方法检测HCVRNA,HCVRNA阳性患者采用型特异性引物分型法确定病毒基因型;选择其中未经干扰素治疗的43例1b型慢性丙型肝炎患者的血清标本,扩增E2区,从中选取肝硬化患者4例,慢性非肝硬化患者6例的E2区PCR产物纯化测序,序列采用CLUSTALW与GENBANK上多株不同型别的HCV序列进行比对分析,结果采用Phylip软件构建遗传进化树;并观察E2区高变区1(HVR-1)的氨基酸(amino acid, aa)残基序列的变异特征;采用单链构象多态性垂直电泳检测43例患者个体内HCV E2区准种的变异情况,比较不同肝病活动度患者准种变异情况。结果表明本地区HCV以1b型为主(84.3%),对E2区基因序列和氨基酸序列变异的分析显示其变异具有一定的规律性,种系进化树提示本地区HCV病毒序列与上海、湖南、日本等地的HCV株有较近的亲缘性。43例患者中ALT高于正常的丙型肝炎患者准种复杂程度明显高于ALT正常者(P0.05)。故本地区HCV基因变异符合中国东南部的特点,基因变异与临床肝病活动度具有相关性。

Hsp70-NP融合蛋白增强诱导HTNV NP特异性CTL的实验研究

李静, 叶正旭, 杨守京, 李铠男, 高娟, 刘彦仿

2006, 21(4): 339

本文采用纯化蛋白Hsp70-NP,NP,Hsp70分别免疫C57/BL6小鼠,取各组小鼠脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验和细胞毒试验。此外,为了获得细胞毒实验的靶细胞,本文还采用脂质体介导质粒pcDNA3.1/S转染黑色素瘤细胞B16,通过G418筛选稳定克隆,并用RT-PCR,Western blots 以及免疫荧光染色证实N蛋白在胞浆中表达。淋巴细胞增殖实验表明,Hsp70-NP,NP组小鼠脾淋巴细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组的增殖指数明显高于NP免疫组。细胞毒实验结果表明,LDH的释放具有效应细胞依赖性,Hsp70-NP,NP免疫组脾淋巴细胞均可以特异性杀伤靶细胞B16-N,而Hsp70-NP免疫组的杀伤率显著高于NP免疫组。实验结果显示,Hsp70可以增强NP诱导产生特异性CTL的能力。本研究结果为进一步设计基于NP的合成肽疫苗或基因疫苗提供了重要实验依据。

SARS冠状病毒基因结构中未知蛋白Orf7的研究

赵琳, 涂亦娴, 于杨, 金华利, 陈则, 王宾

2006, 21(4): 343

为探讨SARS-CoV未知蛋白在基因表达调控中的作用,本研究以鉴定的SARS-CoV BJ01毒株cDNA为材料,采用PCR方法扩增SARS-CoV未知蛋白基因Orf7,Orf8,Orf9,引入GFP和pDsRed作为报告基因,构建出5种表达质粒:pEGFP-Orf7,pEGFP-Orf8,pEGFP-Orf79,pcDNA3-Orf7,pcDNA3-Orf8。进行体外转染实验后,采用荧光酶标仪测量其细胞中荧光蛋白的表达量,再采用流式细胞仪进一步进行瞬时表达的分析比较。结果发现,pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染时,pcDNA3-Orf7能够增强绿色荧光蛋白(GFP)的表达,pEGFP-Orf7与pDsRed共转染时pEGFP-Orf7可以增强红色荧光蛋白(RFP)的表达, 且同时表达红色和绿色荧光的细胞数增加。本文首次证明了ORF7编码的63个氨基酸的蛋白具有反式激活作用,即为SARS-CoV自身的反式激活因子。

RNA干扰抑制人乙型肝炎病毒复制的研究

张正茂, 田拥军, 孟忠吉, 雷延昌, 李新宇, 王宝菊, 杨东亮

2006, 21(4): 348

采用表达shRNA的载体构建了表达针对病毒HBsAg mRNA保守区的shRNA的质粒psiHBs,利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价RNA干扰对HBV复制和基因表达的抑制作用。通过Western印迹检测细胞内的HBsAg,用ELISA检测细胞培养上清和血清中的HBsAg,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,最后通过免疫组化的方法检测肝组织切片中HBcAg的表达情况。结果显示pHBV1.3和psiHBs共转染HepG2后,与对照组相比病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平下降了90%以上,并且shRNA的作用效率存在序列特异性和剂量依赖性。在高压注射小鼠模型中,psiHBs表达的shRNA使小鼠血清中HBsAg的水平下降了80%以上,免疫组化检测显示,小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了75.1%,而且shRNA的抑制作用至少能持续4d。研究显示载体表达的shRNA无论是在细胞或是在小鼠模型中都能对HBV的复制和基因的表达发挥序列特异性的抑制作用。本研究为我们下一步实现由RNAi介导的基因治疗提供了理论和技术支持。

虎源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立

杨松涛, 高玉伟, 王承宇, 邹啸环, 苏建青, 孙贺廷, 常爽, 郑晓一, 王铁成, 王化磊, 冯娜, 夏咸柱

2006, 21(4): 353

为研究H5N1亚型禽流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,利用本室分离鉴定的虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株(简称HAB/01)H5N1亚型禽流感病毒进行连续10倍稀释后,对4~6周龄雄性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠,测定其MLD50,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为14d。结果感染小鼠呈现出规律的以肺炎为主的临床症状、病理变化及病死率;测得该病毒对小鼠的MLD50为10-7.1/0.05mL。成功建立了虎源H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠的实验模型。

伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析

姚琳, 方六荣*, 肖少波, 潘永飞, 谢京国, 陈焕春

2006, 21(4): 358

以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第 159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187 到第241个氨基酸残基之间。上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定

李玉峰, 姜平*, 蒋文明, 汤景元

2006, 21(4): 364

应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株S1毒株的GP5基因序列,然后通过KpnI 和XhoI酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所克隆入的基因以正确的阅读框插入。获得的重组穿梭载体经线性化后与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183菌株。纯化的重组腺病毒质粒经酶切线性化后转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒经纯化后进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证明了用PRRSV GP5蛋白基因所构建的重组腺病毒成功的表达了GP5蛋白。猪体免疫试验后收集血清进行中和实验证明所构建的重组腺病毒在猪体内能够诱导产生中和抗体,因此我们所构建的重组腺病毒可以作为PRRSV基因工程疫苗研究候选病毒株。

动物园大型猫科动物犬瘟热的免疫监测

李梅荣, 唐泰山, 张常印, 王凯民, 李明杰, 程家求, 陆承平

2006, 21(4): 368

虎、狮、豹等大型猫科动物可发生犬瘟热(CD),有必要进行预防。采取某动物园未免疫的东北虎、非洲狮、猞猁血样,用中和试验检测,结果显示这些动物的犬瘟热病毒(CDV)抗体水平均小于1:5。用CD弱毒疫苗接种以上动物,幼龄动物免疫14d逐步产生抗体;成年动物体内抗体水平在两月内迅速升高,并维持在1:64以上,9~11个月后逐步下降,加强免疫后抗体又迅速升高至≥1:112。该疫苗对所有接种的动物均安全可靠。白化的孟加拉虎接种疫苗后不能产生CDV中和抗体。

猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立

冯志新, 姜平*, 王先炜, 李玉峰, 许家荣

2006, 21(4): 371

设计合成了一套引物和TaqMan探针,特异性扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因,在国内首次建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法,且该方法具有较好的特异性和重复性,对PCV2DNA检测下限为1copy/μL ,敏感性比常规PCR高106倍;分别用该法和普通PCR方法对PMWS人工发病猪的10份组织及30份血清样品检测,结果表明该方法具有更快速、灵敏、准确、低污染等优点,并可以对PMWS的早期检测、预防起到指示作用。

口蹄疫病毒3D基因的克隆表达及功能分析

张倩, 顾潮江, 石立立, 李勇, 屈三甫, 郑从义*

2006, 21(4): 375

利用RT-PCR技术扩增了口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,并将其克隆到原核表达质粒载体pET-28a(+)中。3D基因经测序确认后在大肠杆菌BL-21中表达,表达产物纯化的目的蛋白进行Western-blotting检测,获得分子量约55KDa的单一3D基因表达产物。利用RNA体外复制体系和荧光定量PCR技术,证明纯化的3D基因表达产物RNA依赖的RNA聚合酶具有较高的酶活性,可以在体外从头合成FMDV RNA,且主要以引物依赖的方式合成病毒基因组。

犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

鞠会艳, 夏咸柱, 高玉伟, 杨松涛, 邹啸环, 黄耕, 李彦舫

2006, 21(4): 380

核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108—1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAXΔE3LPN。以含CAV-2 SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变。电镜负染、切片观察,酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa。

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

钟金栋, 花群义, 肖荣海, 夏雪山, 杨云庆, 周晓黎, 董俊, 邓祖洪

2006, 21(4): 385

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDV VP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13 kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Western blotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

杜以军, 姜平, 李玉峰, 王先炜

2006, 21(4): 390

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α。该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107 TCID50/mL。RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。

贵州省安龙县狂犬病的流行病学研究

张永振, 熊成龙, 王定明, 周敬祝, 王昭孝, 张永荣

2006, 21(4): 394

为了探讨局部地区暴发流行的因素,对2004年与2005年间在贵州省安龙县及其周边发生的人间狂犬病进行个案调查,用直接免疫荧光法检测犬脑组织中的狂犬病毒抗原,用RT-PCR法扩增G基因片段,测定核苷酸序 列并构建系统发生树进行遗传特征分析。自1994-2003年安龙县报告无人间狂犬病疫情,但于2004与2005年分别报告44例与27例人狂犬病。71例狂犬病患者中68人被犬所伤,3人被猫所伤。在有完整记录的69例患者中,潜伏期平均为47.5d(10~282),13例狂犬病患者的潜伏期≤15d(18.84%);32例的潜伏期≤30d(46.38%),尤其是在2004年的患者中,潜伏期≤20d的病例有13例,占30%。2005年在疫点周围采集的85只犬脑组织中,5只犬脑组织狂犬病毒抗原阳性,阳性率为5.88 %。A13株与A48株病毒之间的G基因核苷酸序列同源性为86.5%,与已报道病毒株比较发现,A13株与广西分离株有最高的同源性,而A48株却与印度尼西亚分离株SN01-23的同源性最高。比较分析两株病毒G基因编码的氨基酸序列,发现包括GⅠ、GⅡ,以及GⅢ抗原位点内的区间,A13与A48分别有19和28个氨基酸位点发生了氨基酸的替代。用全G基因核苷酸序列进行系统分析发现,两株毒株全为Ⅰ型狂犬病毒。结果表明引起安龙县的狂犬病流行的病毒不是新型狂犬病毒,犬饲养量大与病毒携带率高是狂犬病发病暴发流行的直接原因。

马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析

张万菊, 赵淑玲, 张小霞, 汤显春, 肖宇宙, 梅春蕾, 孙修炼, 彭辉银

2006, 21(4): 401

马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a (+) 载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合。

水稻矮缩病毒昆明分离物抗血清制备及免疫捕捉PCR检测

彭潞波, 李婷婷, 魏春红, 方琦, 董家红, 张丽珍, 苏晓霞, 丁铭, 张仲凯, 李毅

2006, 21(4): 408

By Using the modified method to extract Rice dwarf virus virions from infected rice leaves, a concentration 3.854mg/mL of purified virus virions reached, and the Rabbits was immunized with purified virions, yielding high titer antiserum; 1:20480 by the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) test. The antiserum successfully detected three rice samples from Kunming, Yuxi and Luliang by I-ELISA.Immunocapture polymerase chain reaction (IC-PCR), respectively was the utilized to show that serologic and molecular methods were successfully used for detection of Rice dwarf virus.
Brief Reports

猪圆环病毒PCR检测方法的优化

董志强, 张志, 李晓成, 陈德坤, 张燕霞, 黄保续

2006, 21(4): 405

Three pairs of primers P1/P2, P3/P4 and P5/P6 of porcine circovirus 2 were designed and synthesized to compare the sensitivity and specialization to amplify products of 404bp, 647bp and 1773 bp. Optimum dilution of PK15 cell genome infected with PCV 2 was achieved with 10-6ng, 10-5ng to yield from the three pairs of primers. It was also confirmed that P1/P2 were 68.4% successful in detecting PCV2 in 57 swine samples from the province of Fujian, The other primers, P3/P4, P5/P6, were only 57.9% and 8.7% successful, respectively. We conclude that p1/p2 is the optimum primer pair for surveying incidents of PCV2 in pigs.