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2006年21卷5期

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Research Article

HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

刘连兴, 郝彦玲, 袁国亮, 许斌, 傅晶晶, 刘勇, 邵一鸣

2006, 21(5): 413

采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶P31蛋白,目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的30%左右。通过包涵体洗涤和离子交换层析,蛋白纯度高于95%。用纯化后的P31抗原制备成条带免疫试纸条,检测HIV参考品血清时表现了很好的灵敏度和特异性。本研究为进一步开发HIV-1血清学诊断试剂盒奠定了基础。

慢性病毒性肝炎小鼠动物模型的建立及其特征分析

覃小敏, 张江国, 苏凯, 杨超, 严伟明, 宁琴*

2006, 21(5): 417

慢性病毒型肝炎是一种严重危害人类健康的常见病,多发病,目前尚缺乏理想的实验动物模型来阐明其具体的发病机制,从而使得对其防治的研究受到限制。本研究采用纯化的3型鼠肝炎病毒(MHV-3)经腹腔注入近交系C3H/HeJ小鼠体内,小鼠感染MHV-3后,约63%存活,存活的小鼠一般情况较正常对照组差,肝脏组织呈现持续炎性改变,血清ALT、AST升高而TP、ALB有所下降,与人类慢性病毒性肝炎的发生发展极为相似,可作为研究慢性病毒性肝炎的比较理想动物模型。

丙型肝炎病毒5‘非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

陈娟, 陈维贤, 慕生枝, 张君, 黄爱龙*

2006, 21(5): 421

在前期工作已证实HCV基因组5’UTR DNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5’UTR 不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5’UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5’UTR cDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较。结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5’UTR cDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14。 结果提示结构域III是HCV5’UTR DNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5’UTR DNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5’UTR DNA序列的启动子活性;HCV5’UTR cDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高。

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究*

黄现青, 别小妹, 陆兆新, 吕凤霞, 杨淑晶

2006, 21(5): 426

本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽(Antimicrobial lipopeptide,AMI)的体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨。结果表明该抗微生物脂肽对猪肾(Porcine Kidney,PK-15)细胞的半数中毒浓度(Median Toxicosis Dose,TD50)和最大无毒浓度(TD0)分别为47.57 mg/L、18.9 mg/L;对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应(Cytopathic Effects,CPE)有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染和复制。由此可知,该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株,从而抑制其对PK-15细胞的感染作用,其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV),但由于其对PK-15细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究。

浙江省首例人禽流感病例的病原学与分子生物学研究

严菊英*, 卢亦愚, 茅海燕, 冯燕, 徐昌平, 史雯, 翁景清, 李敏红, 龚黎明, 葛琼, 周敏

2006, 21(5): 430

为确认浙江省首例疑似人禽流感病例,进行病原学分析,对患者气管吸出物进行核酸RT-PCR、荧光定量RT-PCR检测以及病毒分离,并对患者血清进行HI抗体测定。结果表明:患者气管吸出物H5N1亚型和A型流感病毒特异核酸均呈阳性,分离到禽流感病毒A/Zhejiang/16/06(H5N1)株;双份血清中禽流感病毒(H5N1)HI抗体滴度分别为1:320和1:640,从病原学和血清学上证实为人禽流感病例。分离毒株测序结果显示,A/Zhejiang/16/06(H5N1)株在HA裂解位点为多个碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒特征;该毒株的HA、NA、PB2、NP、M和NS基因序列均为禽源,与2005年我国福建、安徽等地禽流感病毒分离株高度同源,而与越南、泰国以及香港1997年分离到的禽流感病毒株之间存在明显差异。

分子内二硫键对HERV囊膜蛋白融合核心结构的影响

冯慧星, 黄力勤, 龚睿, 彭小雪, 康舒里, 田波, 肖庚富*

2006, 21(5): 437

合胞素(Syncytin)是一类由人俘获的逆转录病毒囊膜蛋白,与胎盘的形态发生中细胞滋养层到合胞滋养层的分化过程十分相关。Syncytin 与人免疫缺陷病毒I型(HIV-1) 囊膜蛋白(Env)在结构上具有相似的特点,二者可能具有相似的膜融合机制。本文通过PCR对融合核心部位七肽重复区HR1和HR2之间linker中自然存在的一对保守的分子内二硫键进行定点突变,表达纯化该突变蛋白,并进行了相应的结构及稳定性探讨,通过与未突变蛋白的性质比较确证该分子内二硫键在蛋白结构的正确形成及稳定性上起着一定的作用。

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒基因组的克隆与全序列分析

刘淑英*, 马学恩, 齐景伟, 王宇

2006, 21(5): 443

本研究参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列,设计合成8对引物,从内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺肿瘤组织中提取总DNA为模板,对JSRV-NM株基因组分8段进行PCR扩增,产物分别为8个(531bp, 888bp, 949 bp, 944bp, 1428bp, 947bp, 1836bp, 538bp)基因片段,将其分别克隆入pMD-18 T载体中进行双向测序并拼接序列,获得完整的JSRV-NM株前病毒基因组全序列。结果表明,JSRV-NM株前病毒基因组全长7430bp,有相互重叠的4个较长的开放阅读框(ORF),分别代表gag、 pro、 pol 和 env基因。与绵羊肺腺瘤病毒Ⅰ型即南非代表株(NC-001494)和绵羊肺腺瘤病毒Ⅱ型即美国代表株(AF105220)的核苷酸同源性比较分别为90.4%和90%,推导出的氨基酸同源性分别为90%和89.1%。分析JSRV-NM株基因组结构,发现在LTR的上游和下游都具有外源性exJSRV特有的ScaⅠ酶切位点,在gag基因编码的NC区发现有2个较典型的“胱氨酸—组氨酸序列”,可形成锌指结构。在env基因编码的TM区有特异性的“YXXM”基序。用地高辛标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段制成探针,原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织中JSRV-NM的 RNA及前病毒DNA,结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达, 说明JSRV-NM株是具有致瘤作用的外源性反转录病毒。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列。

应用改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平

石立立, 顾潮江, 张倩, 张玮莹, 李勇, 鲁彬, 何成, 屈三甫, 郑从义*

2006, 21(5): 449

将改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析。结果表明:对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达l0个基因拷贝,可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好,所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6.9×104拷贝/μL;与实时SYBR GreenⅠ染料RT-PCR技术比较,改良的实时TagMan荧光定量RT-PCR技术检测灵敏度高6.7倍。以上结果证实,改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性。

口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK-21细胞中的表达

龚真莉, 刘湘涛*, 田宏, 吴锦艳, 代兴国, 尚佑军, 陈国栋

2006, 21(5): 454

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDV P1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别而且具有良好的生物学活性。这一结果的取得,为进一步研制新型口蹄疫基因工疫苗及其配套诊断试剂奠定了基础。

犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究

乔军, 夏咸柱, 杨松涛, 高玉伟, 鞠会艳, 胡桂学, 黄耕

2006, 21(5): 458

对国内分离的犬冠状病毒(CCoV)DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白(M)基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。DXMV、V1和V2流行株与Insavc-1疫苗株M基因相比,核苷酸的同源性分别为92.6% 、90.9%和91.6%,推导的氨基酸序列的同源性分别为92.5%、92.0%和92.3% ,在M基因前1/3区域内存在变异,其中74-76、120-124和131-135三个区域变异较大。国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-17 5个流行株M基因核苷酸同源性为96.6%,推导的氨基酸序列同源性为96.4%,显示出很高的保守性。基于M基因的遗传进化分析表明,目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因II型,只有Fox3-1和Rac2-1两个毒株属于基因I型。另外,将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中,在BL21(DE3)中实现了M蛋白的表达,表达量约占菌体蛋白的10.2%。

伪狂犬病病毒ul24基因表达蛋白胞内定位研究

苏鑫铭, 徐亚林, 于春梅, 曹瑞兵, 周斌, 陈溥言

2006, 21(5): 463

根据GenBank已发表的PrV ul24基因序列(NC006151),设计并合成一对引物,PCR扩增出ul24基因编码区,克隆于pEGFP-N1载体,得到重组质粒pUL24-GFP。酶切鉴定,测序及Western Blot验证重组质粒。ul24基因序列测定结果已提交GenBank,登录号DQ226544。Western blot分析结果表明UL24-GFP融合蛋白为45KD。将pUL24-GFP转染真核细胞,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞内定位,结果表明UL24-GFP融合蛋白定位于细胞核。

鸡传染性支气管炎病毒变异株(793/B)核蛋白基因的克隆与序列分析

孟凡磊, 刁有祥*, 王辉, 刘方娜, 王妮

2006, 21(5): 468

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV 793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明,IBV 793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV 793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86.9%~91.4%,氨基酸同源性为75.8%~77.5%。表明IBV 93/B的N基因存在着较大的变异性。

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

卢亦愚*, 严菊英, 冯燕, 徐昌平, 史雯, 茅海燕

2006, 21(5): 472

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107~102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

王晓艳, 文刚, 高玉龙, 高宏雷, 王笑梅

2006, 21(5): 477

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a(+) 中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1。将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达。该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清。以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上。以Western blot 检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA 疫苗的构建与免疫试验

姬向波, 刘文波, 魏建超, 牛明福, 周斌, 曹瑞兵, 陈溥言*

2006, 21(5): 481

本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB,质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性。为测定该DNA疫苗的免疫效果,将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫,然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以pcDNA-gB/rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多。上述研究结果为ILTV 新型疫苗的研究奠定了基础。

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

万超, 温国元, 潘兹书, 张楚瑜, 熊中良, 杨峻, 艾地云

2006, 21(5): 485

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/L,灵敏度达102拷贝/LDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

李玉峰, 姜平*, 许家荣, 蒋文明

2006, 21(5): 490

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3′和5′ 基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV S1株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSV S1株基因组全长15441 bp,包含9个开放式阅读框,5′UTR含有189nt,3′端UTR含有181nt,其中包含30nt Poly (A)。基因组序列分析结果显示该病毒与ATCC VR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%。与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%。

荧光定量PCR定量检测样品中SeMNPV有效成分

杨和平, 孟小林*, 徐进平, 王健, 鲁伟

2006, 21(5): 494

采用NCBI提供的BLAST软件在线检索SeMNPV特异性基因ORF22、ORF40,并将其构建到pMD18-T载体上。以纯化的pMD18-T-ORF22、pMD18-T-ORF40质粒为标准样品,已计数野生型SeMNPV的基因组作对照,用荧光定量PCR检测样品中SeMNPV多角体含量。荧光定量PCR检测得到标准曲线方程为con=10(-0.282CT+9.965) (相关系数:R2=0.9997)和con=10(-0.296CT+9.945) (相关系数:R2=0.9995)。测得一个SeMNPV多角体包含102核酸分子,检测到SeMNPV复合剂包含 633 PIBs/mg、691 PIBs/mg SeMNPV多角体,两者结果一致。与复合剂中SeMNPV实际含量相符。

新疆分离菌株的提取物对 噬菌体紫外诱导的抑制作用

邹颖颖, 方呈祥*, 杨桥, 罗雪松, 周国玲, 张磊, 唐雅丽, 李红, 张珞珍, 辛晓红

2006, 21(5): 499

本研究从我国夏季高温、强辐射的新疆塔里木地区采集样品,进行了细菌的分离、纯化及分类鉴定。用丙酮萃取法抽提39个分离菌株的培养产物,通过高效液相色谱和紫外-可见吸收光谱分析其主要组分;利用λ噬菌体紫外诱导系统研究抽提物清除自由基的能力。高效液相色谱和紫外-可见吸收光谱分析的结果表明:多数分离菌株丙酮提取物的主要组分为类胡萝卜素物质。λ噬菌体紫外诱导系统抑制实验结果表明:29个菌株的丙酮提取物对λ噬菌体的紫外诱导具有不同程度的抑制作用,抑制率最高达81%。不同菌株之间的比较试验显示不同属细菌的丙酮提取物对λ噬菌体紫外诱导系统的抑制效果存在很大差异,其中以Methylobacterium的抑制作用最强;不同颜色菌株提取物的抑制效果也出现较大差异;Koanria中不同颜色菌株的抑制效果也有类似结果。本文为类胡萝卜素可能是该类细菌具有抗辐射能力的内因之一提供了直接证据。同时,也证实了λ噬菌体紫外诱导系统是一种很好的探讨细菌抗辐射机理的研究模型。
Brief Reports

侵染花生的辣椒褪绿病毒SRNA全序列分析

陈坤荣, 许泽永, 晏立英, 王国平

2006, 21(5): 506

A new tospovirus was discovered in infected peanut plants based on complete sequencing and analysis of its genomic S RNA. It was characterized as a new strain of Capsicum chlorosis virus (CaCV) and was named China peanut (CP) strain. The total sequence of S RNA of CaCV-CP was 3399 nucleotide (nt) and contained two open reading frames (ORFs) with an ambisense arrangement. ORF1 was 1320nt encoding a 49.9 kDa nonstructural (NSs) protein. ORF2 is 828nt encoding a 30.7 kDa nucleocapsid (N) protein. The N gene of CaCV-CP shared 84.7%~86.4% and 92.4%~93.1% identity with that of CaCV strains from Thailand and Australia at the nucleotide and amino acid levels, respectively. This is the first report of complete sequence of CaCV S RNA and occurrence of CaCV in China.

用巢式RT-PCR检测精神分裂症患者血液标本中HERV env基因

肖颖, 黄文杰, 刘忠纯, 朱帆, 吴建国

2006, 21(5): 510

The association between transcriptional activation of HERV and the develop- ment of schizophrenia was investigated. Nested RT-PCR was used to detect the preval- ence of HERV env RNA in the PBMCs of individuals with recent-onset of schizophrenia and normal persons from central and southern China. β-actin gene was used as an internal control. HERV env homologous sequences were found in the PBMCs of 8 of 28 (28.6%) individuals with recent-onset schizophrenia, while no env sequences were identified in any of the PBMCs obtained from 24 normal person (P0.001). The results suggested that transcriptional activation of HERV might be associated with the develop- pment of schizophr- enia in at least some patients.

肠道病毒ECHO20血清型鉴定和VP1序列初步分析

马进, 丁峥嵘, 蒋立虹, 刘建生, 李亚雄, 陈智豫, 孟明耀, 王萍, 侯宗柳

2006, 21(5): 513

Hepatitis A virus and ECHO20 viruses were isolated from faeces of hepatitis A patients in Luxi County, Yunnan Province. The combined and single serological neutralization antibody tests of enterovirus demonstrated that the patients were infected by both viruses. One strain, named LX0901, was selected for RT-PCR by using the general primers of VP1 of enterovirus. The product was purified and sequenced. The data were deposited in GenBank and compared with the complete VP1 sequence of 3 isolated ECHO20 strains. Analysis indicated that the LX0901 strain was ECHO20 virus, which was in agreement with serological neutralization tests. The variations of amino acids were not so high with an identity of more than 97%, but the variation were distributed throughout the genome.

黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物外壳蛋白基因与3’非编码区的序列分析

陈红运, 白静, 朱水芳, 赵文军, 李明福

2006, 21(5): 516

The coat protein gene and its 3′ noncoding region of a watermelon isolate of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV-LN) in Liaoning, China was determined and compared with other isolates. The gene encoding the coat protein of CGMMV-LN comprises of 486 nucleotides and encodes a putative protein of 161 amino acids. Sequence comparisons showed that the coat protein of this isolate was identical to that of seven CGMMV isolates infecting cucurbits in Europe and Asia. The 3′ noncoding region of CGMMV-LN consists of 176 nucleotides, which is same as that of CGMMV-KOM, CGMMV-KW and CGMMV–SH.
Review

单纯疱疹病毒1型VP16蛋白和VHS蛋白研究进展

张春龙, 王一飞*, 张美英

2006, 21(5): 519

单纯疱疹病毒1型(HSV-1);VP16蛋白;VHS蛋白

SHIV及其在AIDS疫苗和药物研究中的应用

刘强, 杨贵波, 邵一鸣*

2006, 21(5): 523