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2007年22卷1期

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RESEARCH PAPERS

SARS-CoV S蛋白与受体ACE2结合的功能区域研究

张翼, 王薇, 叶力, 方小楠, 曾莹春, 吴正辉, 佘应龙, 叶林柏,

2007, 22(1): 1

摘要:SARS冠状病毒是一种新发传染病严重急性呼吸系统综合征的病原体。病毒的S蛋白通过与靶细胞表面的特异受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合,在病毒的吸附和侵入过程中起到了重要的作用。为了确定S蛋白与ACE2结合的功能区域,我们在大肠杆菌中表达了7个从N端截短或从C端截短的S蛋白,并用Ni柱纯化。将各个截短的蛋白包被在96孔ELISA板上,与ACE2作用,再用ACE2蛋白的兔抗血清作为一抗检测截短的S蛋白与ACE2的结合情况。ELISA结果显示,S蛋白中编码氨基酸388~496的序列是受体结合的功能区域;用这段截短的S蛋白免疫家兔得到的抗血清能够有效地阻断S蛋白与ACE2的结合。该结果为S蛋白发展为SARS疫苗提供了实验依据。

乙型肝炎病毒感染性复制子的构建及其特性

卢银平, 王宝菊, 董继华, 刘朝, 管世鹤, 陆蒙吉, 杨东亮

2007, 22(1): 8

摘要: 为了构建乙型肝炎病毒(HBV)感染性复制子表达载体,建立HBV体外复制细胞模型,我们以含HBV双倍基因组的质粒pHBV-dimer为模板,用PCR结合限制性酶切的方法分步将1.3拷贝HBV基因组克隆到pCR2.1载体。将构建的HBV复制子pHBV1.3质粒体外转染Huh7细胞,分析转染后不同时间HBsAg、HBeAg表达及HBV复制中间体和转录子水平,并利用该细胞模型进行阿德福韦抗病毒研究。 结果表明成功构建了HBV感染性复制子表达质粒,该质粒上HBV基因能在Huh7细胞中进行高水平复制、转录和表达,并能在体外短期传代达12天。阿德福韦能体外抑制该HBV复制子的复制,抑制程度依赖于药物浓度。新构建的HBV感染性复制子表达载体可介导高水平病毒复制,有望用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究

Inhibition of Hepatitis B Virus Replication by Rheum palmatum L. Ethanol Extract in a Stable HBV-producing Cell Line

2007, 22(1): 14

Hepatitis B virus(HBV) infection is a severe health problem in the world. However,there is still not a satisfactory therapeutic strategy for the HBV infection. To search for new anti-HBV agents with higher efficacy and less side-effects,the inhibitory activities of traditional Chinese medicine Rheum palmatum L. ethanol extract(RPE) against HBV replication were investigated in this study. Quantitative real-time polymerase chain reaction(PCR) was employed to analyze the inhibitory activity of RPE against HBV-DNA replication in a stable HBV-producing cell line HepAD38; the expression levels of HBV surface antigen(HBsAg) and e antigen(HBeAg) were also determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) after RPE treatment. RPE could dose-dependently inhibit the production of HBV-DNA and HBsAg. The concentration of 50% inhibition(IC50) was calculated at 209.63,252.53μg /mL,respectively. However,its inhibitory activity against HBeAg expression was slight even at high concentrations. RPE had a weak cytotoxic effect on HepAD38 cells(CC50= 1 640μg /mL) and the selectivity index(SI) was calculated at 7.82. Compared with two anthraquinone derivatives emodin and rhein,RPE showed higher ability of anti-HBV and weaker cytotoxicity. So Rheum palmatum L. might possess other functional agents which could effectively inhibit HBV-DNA replication and HBsAg expression. Further purification of the active agents,identification and modification of their structures to improve the efficacy and decrease the cytotoxicity are required.

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28单克隆抗体的制备 和特性研究

谷万港, 袁军法, 徐葛林, 李莉娟, 刘妮, 张聪, 张建红, 石正丽

2007, 22(1): 21

摘要:用纯化的对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)免疫BALB/c小鼠,用大肠杆菌表达的VP28蛋白通过ELISA方法筛选到六株抗囊膜蛋白VP28的单抗细胞株。用这6株单抗体外中和病毒后进行感染实验,结果表明,其中的4株单抗对病毒有中和作用,可以明显延缓螯虾被病毒感染后的起始死亡时间。Western blot杂交显示,所有单抗均为针对VP28空间结构的抗体。挑选其中的一株单抗7B4,用胶体金进行标记可以将VP28定位在病毒囊膜上。这些单克隆抗体可以用于建立WSSV的诊断技术。

中国分离的狂犬病毒G-L基因间隔区的序列测定与分子流行病学

孟胜利, 徐葛林, 严家新, 明平刚, 吴杰, 杨晓明, 明贺田, 朱凤才, 周敦金, 肖奇友, 董关木

2007, 22(1): 26

摘要:在2004-2006年期间,从中国不同地区共收集到25株狂犬病毒,其中24株是从犬脑分离,1株是从人脑分离。对这25株街毒株和7个代次的CTN疫苗株的G-L基因间隔区进行了序列测定和系统进化关系分析。结果显示:所有中国毒株的G-L基因间隔区都由519个碱基构成,这25株街毒株之间核苷酸序列同源性为95.5%-100%。本文所分析的所有中国毒株都属于基因 1型,其详细分布情况与地理上的来源相关。这些毒株共可分为密切相关的两个类群,所有街毒株为一个类群,不同代次的CTN疫苗株为另一个类群。此项研究提供了狂犬病毒基于G-L基因间隔区序列的分子流行病学详细资料。

重组新城疫病毒表达绿色荧光蛋白基因*

胡顺林, 孙庆, 王曲直, 刘玉良, 吴艳涛, 刘秀梵*

2007, 22(1): 34

摘要:将新城疫病毒 ZJI株基因组cDNA全长分成七个片段,依次连接并克隆至TVT7R转录载体中,构建了含ZJI株全基因组cDNA的转录载体 (pNDV/ZJI), pNDV/ZJI与三个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5 细胞,成功拯救出了具有感染性的新城疫病毒粒子。根据新城疫病毒的基因组结构特点,设计用于扩增绿色荧光蛋白 (GFP)基因的一对引物,利用引物两端添加的酶切位点将含有GFP基因的片段引入到 ZJI株基因组中,构建了转录载体pNDV/ZJIGFP,将pNDV/ZJIGFP与三个辅助表达质粒共转染BSR-T7/5 细胞,成功拯救出了重组的新城疫病毒,命名为NDV/ZJIGFP。重组病毒感染BSR-T7/5和鸡胚成纤维细胞48h后,在荧光显微镜下能见到明显的绿色荧光,表明GFP基因在病毒的增殖过程中得到了较好的表达,这为进一步利用该病毒进行其它外源基因的表达及新型重组疫苗的研制打下了基础。

一株新的SV40分离株—— SV-IMB的全基因组序列分析

张雪梅, 车艳春, 王晶晶, 刘龙丁, 谢明学, 李琦涵*

2007, 22(1): 41

摘要:我们对分离自恒河猴指名亚种的一株SV40——SV-IMB进行了全基因组序列测定,并与其它分离株进行了比较分析。结果表明:SV-IMB基因组全长5246bp,与其它毒株的平均同源性为98.1% 。调控区具有一个完整的增强子和一个缺损的增强子。大T抗原和VP1都发生了不同程度的氨基酸变异。结果表明这是一株新的SV40分离株。

H5N1 亚型禽流感病毒M基因NP基因的克隆 及其DNA疫苗的免疫保护效力

范鸿博, 李军伟, 李志林, 郑炜, 郭德银*,

2007, 22(1): 46

摘要:应用禽流感病毒反转录通用引物和H5N1亚型禽流感M基因、NP基因的型特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004株的M基因和NP基因,并将M基因和NP基因成功克隆到pMD18-T载体中。以pHM6为载体分别构建了表达M基因和NP基因的真核表达质粒pHM6-m 和pHM6-np,测序鉴定。采用肌肉注射法分别以30μg pHM6-m质粒,30μg pHM6-np质粒,pHM6-m和pHM6-np各15μg混合质粒一次免疫6周龄BALB/c小鼠,2周后用同源病毒以鼻腔接种途径进行攻毒,接下来12天内观察小鼠发病死亡情况。攻毒后pHM6-m质粒组免疫保护率为62.5%,pHM6-np质粒组免疫保护率为25.0%,pHM6-m和pHM6-np混合质粒组免疫保护率为50.0%。表明所构建的H5N1亚型禽流感病毒M基因、NP基因的真核表达质粒均可作为DNA疫苗诱导有效的免疫保护,且pHM6-m质粒免疫保护效果优于pHM6-np质粒。

小蔗杆草螟浓核病毒(Diatraea saccharalis densovirus,DsDNV)对宿主幼虫的致病性及其及其基因组的特征的研究

彭建新, 李毅,

2007, 22(1): 53

摘要:本文研究了小蔗杆草螟浓核病毒(Diatraea saccharalis densovirus,DsDNV)对宿主幼虫的致病性及其DNA的限制性内切酶图谱。研究结果显示,直到接种病毒的第四天,幼虫开始表现出病毒感染的症状。感染5 天后,幼虫逐渐死亡,死亡率在感染后的第13天和第22天分别达到60%和100%,而相应对照组的死亡率仅为10%和20%。这些结果表明DsDNV对其宿主有高致病性。通过电镜观察病毒DNA及对完整病毒DNA和限制性内切酶酶切DNA片断凝胶电泳,我们得到DsDNV dsDNA全长大约为5.95kb,存在16种限制性内切酶的41个酶切位点。比较DsDNV JcDNV和GmDNV的基因组限制性内切酶图谱发现它们有许多相同的酶切位点,进而推测在这三种病毒中Bam HI, Hha I,Xba I, Cla I, Asp 700, Spe I, Nco I和Bcl I的许多酶切位点保守。我们还根据基因组末端存在的对称性酶切位点推测其末端倒置重复序列(ITR)的大小大约为500bp 。基因组大小的相似,许多相同的酶切位点,存在大约为500bp的ITR表明DsDNV和JcDNV、GmDNV 浓核病毒一样都属于双义浓核病毒。
TECHNIQUES AND METHODS

应用胶体金免疫层析法快速检测对虾白斑综合症病毒(WSSV)

程清宇, 孟小林*, 徐进平, 鲁 伟, 王 健

2007, 22(1): 61

摘要:利用免疫胶体金结合免疫层析法研制了一种快速检测对虾白斑综合症病毒(WSSV)的试剂条。利用大肠杆菌表达系统融合表达了WSSV囊膜蛋白VP (19+28),然后用纯化后的融合蛋白VP (19+28) 作为抗原免疫家兔,制备和纯化了抗WSSV- VP (19+28) IgG。以胶体金标记此抗体制成免疫层析试剂条。此试剂条可以从体液、腮、肝胰腺三种不同组织中检测出WSSV的感染;而且从垂死虾中也可以检测出WSSV的感染;以纯化的VP (19+28)为样品,试剂条的检测下限可达到10ng/mL。同时用WSSV vp 19 的引物进行了PCR检测。二种检测方法得到了完全一致的结果。

利用SELDI-TOF-MS技术检测Vero细胞感染单纯疱疹病毒1的蛋白差异表达

刘志军, 王斌,

2007, 22(1): 68

摘要: 目的 运用SELDI(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization)蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type-1,HSV-1)后蛋白质的差异表达。方法 常规培养Vero细胞,感染HSV-1,孵育12h,24h,48h后细胞裂解液裂解细胞。裂解上清蛋白定量后应用IMAC3(固定金属亲和)芯片,SELDI-TOF-MS技术检测细胞感染前后蛋白质组学的差异。结果 感染24小时细胞出现明显病变(CPE),感染12小时质谱分析即可见蛋白的差异表达。共9个蛋白表达水平发生变化。其中10140,11284,16912,17050,17218,17581 Da在细胞感染后表达增高,而6278,6650,18906 Da表达降低。16921Da和17581Da的蛋白峰符合ISG15,可能与细胞针对HSV-1感染过程有关。结论 SELDI蛋白芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达方法简便,敏感性高,重复性好,从而为从蛋白质水平研究HSV-1感染的致病机理,HSV-1与宿主细胞的相互作用,及抗感染治疗靶位的寻找奠定了一定的基础。

鉴别口蹄疫病毒感染与免疫动物的三种不同 ELISA试剂盒的比较研究

曹轶梅, 卢曾军, 刘在新*, 谢庆阁

2007, 22(1): 74

摘要:为了进一步验证本实验室研制的鉴别口蹄疫病毒感染牛与免疫牛的FMD 3ABC-I-ELISA试剂盒的有效性,我们进行了该项研究。分别用ceditest?、 UBI?与本实验室研制的FMD 3ABC-I-ELISA三种口蹄疫非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒对不同的血清样品(非免疫健康牛血清、灭活疫苗免疫牛血清、人工感染牛血清)进行检测。初步确定其敏感性与特异性,并将结果进行比较。结果表明,FMD 3ABC-I-ELISA与ceditest?非结构蛋白抗体检测试剂盒的符合率在98.05%以上,而与UBI?的符合率为94.4%。对感染牛来说,FMD 3ABC-I-ELISA和ceditest?两种试剂盒的敏感性都达到100%,而UBI?敏感性较低,只有81.8%。对免疫牛和健康牛来说,三种试剂盒的特异性都在90% 以上。