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2007年22卷3期

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Research Article

凝血酶原酶基因在小鼠SARS模型肺损伤中的作用

严伟明, 黄加权, 宁琴, 罗小平

2007, 22(3): 181

本研究利用鼠肝炎3型病毒(MHV-3)通过呼吸道途径建立了小鼠严重急性呼吸综合征(SARS)模型,进一步探讨了小鼠fgl2凝血酶原酶基因(mfgl2)与SARS肺损伤,尤其是透明膜、血栓形成之间的关系及其临床意义。结果表明该小鼠SARS模型能够良好的模拟人类SARS肺损伤的疾病特征,肺脏呈现典型间质性肺炎样改变伴透明膜、血栓形成,感染小鼠于5天内死于以肺损伤为主的多器官衰竭;作为一种促炎症因子,在肺脏支气管浆液腺上皮细胞、间质浸润细胞、肺泡细胞可检测到mgl2的特异性表达,肺内透明膜及微血栓形成的区域多见mfgl2与纤维素的共沉积,提示mfgl2可能是SARS肺损伤又一重要分子机制。

干扰素诱导的鸟苷结合蛋白1(GBP-1)体外介导了抗柯萨奇病毒B3的作用但不能抑制乙型肝炎病毒的复制

卢银平 王宝菊 董继华 刘朝 管世鹤 陆蒙吉 杨东亮, 王宝菊, 董继华, 刘朝, 管世鹤, 陆蒙吉, 杨东亮

2007, 22(3): 193

鸟苷结合蛋白1(GBP-1)是干扰素诱导产生的67kd蛋白质。为观察人GBP-1对乙型肝炎病毒(HBV)和柯萨奇病毒B3(CVB3)的抑制作用, 我们通过长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因,插入到pCR2.1 TA克隆载体,再亚克隆到pCDNA3.1(-)真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞,分别观察hGBP-1对乙型肝炎病毒体外复制子pHBV1.3和柯萨奇病毒B3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养上清HBsAg、HBeAg水平;Southern blot检测细胞HBV DNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞CVB3感染量。结果表明构建的hGBP-1真核表达质粒能在HepG2细胞和Hela细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1.3共转染HepG2细胞,不能抑制HBV复制,HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。但转染质粒在Hela细胞上对柯萨奇病毒B3有明显的抑制作用,CVB3感染量显著降低,hGBP-1可能在干扰素介导的抗CVB3中起重要作用。

番茄丛矮病毒p19蛋白抑制哺乳动物细胞内短双链RNA诱导的RNA干扰

陈维贤,

2007, 22(3): 199

为了研究番茄丛矮病毒p19蛋白对RNA干扰的抑制作用,分别构建针对绿色荧光蛋白和虫荧光素酶基因的短发夹状小RNA表达质粒,前者转染稳定表达GFP的细胞株,利用荧光显微镜,蛋白印迹实验和RT-PCR检测该shRNA对内源性GFP的抑制效果;同时构建针对虫荧光素酶基因的短发夹状小RNA表达质粒,与报告质粒共转染,采用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达,验证该shRNA对虫荧光素酶基因的抑制效果。利用此两个RNA干扰体系进一步验证番茄丛矮病毒p19蛋白抑制短发夹状小RNA介导的RNA干扰作用。结果显示,设计的shRNA能够有效的干扰目的基因的表达,而p19则可以对抗该种干扰作用,使靶基因表达水平得到恢复。本研究建立了稳定的RNA干扰体系,并利用该体系证实了p19抑制哺乳动物细胞内shRNA介导的RNA干扰的作用。本研究中所建立的RNA干扰体系,能够用来进行广泛的RNA干扰抑制因子的筛选,为进一步研究RNA干扰的机制奠定了基础。

疱疹病毒β同源蛋白UL2和UL23的进化分析

李琦涵, 刘龙丁,

2007, 22(3): 207

β基因在疱疹病毒的感染、复制、转录及后处理过程生理活动方面发挥着重要的作用。基于目前已知的β基因及其编码产物 ,采用比较基因组和蛋白质组的方法分别探讨疱疹病毒中的β同源蛋白UL2和UL23在属内及其他物种内的保守情况。确定了HSVβ基因编码的非结构蛋白UL2和UL23在疱疹病毒属内部表现很高的序列相似性 ,同时它们在某些原核生物中亦呈现不同程度的保守性。表明与病毒感染复制相关的基因调控机制的保守是病毒进化的重要特征。

Differences in Variation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Sequences from Henan and Shanghai Regions of China

2007, 22(3): 212

Illegally paid blood donation was a risk factor for HIV acquisition exclusively in Henan and Hubei Provinces of China, and not in Shanghai. Nucleotide sequences in the gag and env genes of HIV-1 were compared between isolates from Henan and Shanghai regions of China to test whether an expected higher degree of a common source of infections from this unique blood donation transmission risk would be evident as decreased variation among Henan isolates in an exploratory cross-sectional analysis. Among 38 isolates studied, 23 of 23 (100%) from Henan and 8 of 15 (54%) from Shanghai were subtype B. In addition, fewer sequence differences were found in gp41 of subtype B isolates from Henan than from Shanghai isolates. Further studies with additional controls are therefore warranted to confirm the role of the degree of a common source of infections in differences in HIV variation across populations.

家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac 系统的构建

黄金山, 胡志红,

2007, 22(3): 218

To construct the Bac-to-Bac expression system of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), a transfer vector was constructed which contained an Escherichia coli (E. coli) mini-F replicon and a lacZ: attTN7: lacZ cassette within the upstream and downstream regions of the BmNPV polyhedrin gene. B. mori larvae were cotransfected with wild-type BmNPV genomic DNA and the transfer vector through subcutaneous injection to generate recombinant viruses by homologous recombination in vivo. The genomic DNA of budded viruses extracted from the hemolymph of the transfected larvae was used to transform E. coli DH10B. Recombinant bacmids were screened by kanamycin resistance, PCR and restriction enzyme (REN) digestion. One of the bacmid colonies, BmBacJS13, which had similar REN profiles to that of wild-type BmNPV, was selected for further research. To investigate the infectivity of BmBacJS13, the polyhedrin gene was introduced into the bacmid and the resultant recombinant (BmBacJS13-ph) was transfected to BmN cells. The budded viruses were collected from the supernatant of the transfected cells and used for infecting BmN cells. Growth curve analysis indicated that BmBacJS13-ph had a similar growth curve to that of wild-type BmNPV. Bio-assays indicated that BmBacJS13-ph was also infectious to B. mori larvae.

应用密码偏好性合成的α-2b干扰素在毕赤酵母中的超表达

方斌, 梁布锋, 何光源

2007, 22(3): 226

通过应用毕赤酵母密码子的偏好性和优化G+C含量的方法设计并合成α-2b干扰素基因序列,提高了α-2b干扰素在毕赤酵母的表达量。合成的α-2b干扰素克隆到毕赤氏酵母表达载体pPICZαA。重组表达质粒经限制性内切酶酶切线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。多拷贝的Mut+工程菌株通过提高抗生素Zeocin含量的平板筛选,120小时诱导表达后,SDS-PAGE分析表明工程菌株GS115/pPICZαA-IFNα-2b的表达量达到了810 mg/l。Western blot分析表明工程菌分泌表达蛋白的α-2b干扰素具有免疫抗原性。 通过WISH/ VSV系统证明融合蛋白表现出明显的IFN 抗病毒活性,其α2b干扰素活性大约为3.3×105 IU/mL。

国家免费抗病毒治疗人群HIV-1耐药突变分析

李新平, 邢辉, 王哲, 司雪峰, 王连恩, 程华, 崔为国, 姜树林, 廖玲洁, 周海卫, 黄江虹, 马鹏飞, 邵一鸣,

2007, 22(3): 233

目的 了解我国河南省确山县接受齐多夫定胶囊(zidovudine, AZT)、去羟基肌甘散(didanosine, DDI)和奈韦拉平片(nevirapine, NVP)联合治疗患者抗HIV病毒治疗过程中的病毒学指标的变化,分析耐药株的发生和流行情况。方法 在已开展抗病毒治疗的河南省确山县,自2003年至2004年间共计采集得到431份HIV感染者新鲜抗凝全血标本,每次采样都对被观察对象进行问卷调查,测定病人血浆病毒载量,采用套式PCR引物对目的基因片断进行扩增,经过测序获得基因序列,并将得到的序列与Stanford HIV Drug Resistance Database(http://hivdb.stanford.edu)中的参考株序列进行比较,分析与已知耐药序列的关联情况。结果 未接受抗病毒治疗患者病毒载量小于检测限(LDL)的比率为38.5%(40/104),治疗0-6月时间组上升到61.9%(60/97),差异有显著性(χ2=10.987,p=0.001),治疗6-12月时间组及治疗12月以上患者又显著下降,分别为38.6%(54/140)(χ2=12.444,p<0.001)和40.0%(36/90) (χ2=8.926,p=0.003)。未治疗组、治疗0-6月、治疗6-12月及治疗12月以上四组病毒载量高于LDL病人的耐药株流行率分别为7.0%(3/43)、48.6%(18/37)、70.8%(51/72)、72.3%(34/47),治疗6月以上患者显著升高(χ2=6.529,p=0.011)。本研究中没有发现对蛋白酶抑制剂(PI)耐药患者,核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)耐药突变位点出现于治疗6月以上患者中,非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)耐药突变位点治疗开始就出现,在治疗6月以上患者中显著升高(χ2=9.646,p=0.002),出现频率最高的位点为K103N、G190A、Y181C、V106A。治疗6个月后开始出现对NRTI和NNRTI都耐药的患者,在治疗6-12月患者和治疗12月以上患者中出现频率分别为7.0% (5/72) 和 19.0%(9/47)。结论 耐药株在未治疗患者低水平出现,而治疗患者中耐药流行率很高且随治疗时间延长有不断增高的趋势。治疗6月以内患者中病毒抑制情况较治疗前有显著好转,但随着耐药株的出现并显著性上升,治疗6月以上患者病毒抑制情况不理想。因此及时对治疗病人进行耐药性监测,对于明确病人治疗效果、对所用药物的敏感性及下一步的治疗方案具有重要意义。

Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1基因靶向短发卡状RNA表达载体构建方法及功能研究

王祎琴, 张文露, 杨玉成, 洪苏玲

2007, 22(3): 241

目的:探讨两种构建EB病毒LMP1 基因靶向短发卡状RNA表达载体(pshLMP1)方法的不同,寻找更稳定方便的靶向shRNA载体的构建方式; 观察pshLMP1抑制鼻咽癌HNE1细胞中LMP-1基因表达情况。方法:设计针对EB病毒LMP1基因的特异siRNA 编码序列,分别应用传统的双链退火法和新颖的双链PCR法构建pshLMP1,比较两种方法在设计原则、构建方法和鉴定结果上的不同;pshLMP1与pEGFP-N1-1158共转染HNE1 细胞,通过绿色荧光观察,RT-PCR 及蛋白免疫共沉淀法检测LMP-1基因表达水平。结果:两种方法均能得到pshLMP1重组质粒,但是双链PCR法构建效率高且不易引起碱基的缺失和突变;HNE1细胞中LMP-1基因mRNA和蛋白质水平均降低。结论:构建EB病毒pshLMP1表达载体比传统双链退火法更加稳定高效并能有效抑制鼻咽癌细胞中LMP-1 基因表达。双链PCR法能促进RNA干扰技术在抗EB病毒研究中的应用。
Review

卡波氏肉瘤病毒的致病机理

王林定

2007, 22(3): 248

卡波氏肉瘤病毒(KSHV)是造成卡波氏肉瘤(KS),原发性渗透性淋巴瘤(PEL)以及多中心性卡斯特莱曼(MCD)的主要病因.与其他疱疹病毒一样,卡波氏肉瘤病毒可以在宿主细胞中建立潜伏感染和裂解感染.在两种感染状态中,卡波氏肉瘤病毒具有截然不同的基因表达程序.由卡波氏肉瘤病毒编码的一些基因在抑制宿主的获得性免疫和天然免疫,抑制细胞的调亡和调节细胞周期中起着非常重要的作用.卡波氏肉瘤病毒还编码几个具有转染细胞活性和激活细胞内信号传导活性的蛋白.