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2007年22卷4期

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Research Article

Phylogenetic Analysis of Orgyia pseudotsugata Single-nucleocapsid Nucleopolyhedrovirus

Agata Jakubowska, Monique M, van Oers, Imre S

2007, 22(4): 257

The Douglas-fir tussock moth Orgyia pseudotsugata (Lepidoptera: Lymantriidae) is a frequent defoliator of Douglas-fir and true firs in western USA and Canada. A single nucleopolyhedrovirus (SNPV) isolated from O. pseudotsugata larvae in Canada (OpSNPV) was previously analyzed via its polyhedrin gene, but is phylogenetic status was ambiguous. Sequences of four conserved baculovirus genes, polyhedrin, lef-8, pif-2 and dpol, were amplified from OpSNPV DNA in polymerase chain reactions using degenerate primer sets and their sequences were analyzed phylogenetically. The analysis revealed that OpSNPV belongs to group II NPVs and is most closely related to SNPVs that infect O. ericae and O. anartoides, respectively. These results show the need for multiple, concatenated gene phylogenies to classify baculoviruses.

HIV-1缺损慢病毒载体介导的高效基因转移与抑制HIV-1复制

曾令兵, 叶林柏,

2007, 22(4): 266

本文优化了大量制备HIV-1缺损慢病毒载体的方法,对载体转导不同细胞能力以及载体介导的抑制HIV-1复制等进行了研究。用编码病毒组份的三质粒系统共转染293T包装细胞系,病毒载体的度可达到0.5-1.2 x 107IU/mL,经超速离心浓缩,载体滴度可提高100倍以上。HIV-1缺损慢病毒载体可以高效转导多种来源的细胞。在CEM, SupT-1 和 MT-2等细胞中没有检测出具有感染性的可复制病毒。HIV-1慢病毒载体转导的细胞可以持续稳定地表达外源基因,转导细胞的形态和增殖动态没有明显变化。在野生HIV-1病毒感染条件下,载体可以在细胞间转移。克隆培养的HIV-1慢病毒载体转导人T淋巴细胞可以完全抑制野生HIV-1的复制。HIV-1缺损慢病毒载体具有高效稳定转导细胞持续表达外源基因的特点,并且具有抗HIV-1病毒感染的能力,可以作为未来探索HIV-1感染基因治疗技术的一种极具潜力的工具。

Ⅰ型单纯疱疹病毒ICP0抗原多肽在原核细胞中的表达及特异性抗体的制备

李卫中, 寸 韡, 刘龙丁, 车艳春, 罗杰, 王丽春, 董承红, 杨茜, 李琦涵

2007, 22(4): 280

作为单纯疱疹病毒的一种立即早期蛋白,ICP0与宿主细胞间存在着复杂的相互作用,其对基因表达的调控功能尤为重要。由于ICP0的编码序列中含有很多大肠杆菌缺乏的稀有密码子,同时由于ICP0在菌体内的高度不稳定性,因此完整ICP0蛋白在原核内的表达目前尚未见报道。为进一步研究ICP0的功能,将ICP0蛋白氨基端1-105位氨基酸编码序列连入原核表达质粒pGEX-5x-1,实现了GST-105融合抗原多肽在大肠杆菌中的高效表达。免疫小鼠后制备的抗体既能特异性识别变性的ICP0蛋白,又能识别具有正常生理构象的ICP0蛋白。

人类A组轮状病毒Vp4的表达和免疫反应性

赵庆欢, 文喻玲, 于洋, 代青, 陈元鼎*

2007, 22(4): 287

轮状病毒的VP4在病毒的吸附和进入细胞过程中扮演着重要角色。本研究在原核细胞中高效表达了A组人轮状病毒TB-Chen株的外壳蛋白VP4,表达的蛋白具有了良好的免疫反应性,能被抗SA11和Wa株轮状病毒的抗体识别。复性试验得到了部分二聚体,这些结果为VP4的结构和功能进一步研究奠定了基础。

水稻瘤矮病毒5个分离物基因组片段8全长cDNA的克隆及原核表达

邓名荣, 阮小蕾, 刘福秀, 赵芹, 李华平

2007, 22(4): 294

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)是广东部分水稻产区严重的瘤矮病害的病原,开展病原分离物基因组变异研究,是病害防治的基础。本文应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒广东5个分离物(BL, CH, DQ, GZ, YX)基因组片段8(S8)的全序列。结果表明,所有分离物S8片段全长均为1 578 bp,含有一个长1 281 nt的开放阅读框(ORF),编码一条426个氨基酸的肽链,推测分子量为47.4kDa,该蛋白为RGDV主要外层外壳蛋白(Pns8)。广东5个分离物相互间相比较,其全长核苷酸序列和ORF序列分别有97.3%~98.8% 和 97.3%~99.1%的相似性;广东5个分离物与RGDV泰国分离物全长及ORF序列相比较,分别有94.8%~95.6%和95.0%~96.0%的相似性。据核苷酸序列推导的Pns8氨基酸序列,GZ分离物与泰国分离物完全相同,而广东5个分离物间有0.5%~2.1%的变化。这些结果表明,不同地区的分离物的基因组片段8的遗传变异是相对较少的。将完整的XY分离物ORF构建到原核表达载体pET28b(+)上进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果初步表明,RGDV主要外层外壳蛋白在Escherichia coli Rossetta(DE3)Ⅱ中获得了表达。据我们所知,这是系统比较RGDV不同分离物的基因组片段8、以及进行原核表达的首次报道。

中国彝族人群HLA-A、-Cw基因多态性与HIV/AIDS的关联研究

洪坤学, 鲁晓知, 秦光明, 陈健平, 阮玉华, 邢辉, 朱家鸿, 邵一鸣

2007, 22(4): 301

应用PCR-SSP方法分别对彝族人群健康对照组102份样本、HIV感染组68份样本和HIV感染后长期存活组21份样本的HLA-A、-Cw座位进行基因分型,HLA-A、-Cw各等位基因在正常人群、HIV感染人群和HIV感染后长期存活人群中的分布差异借助SPSS软件进行统计分析,以探讨四川彝族人群HLA-A、-Cw基因多态性与HIV感染和发病的关联。结果表明在该群体中HLA-A、-Cw等位基因未表现出与HIV感染的相关性,而A*3601(χ2=9.799,P =0.016,OR=16.833,EF=0.134)、Cw*0304(χ2 = 31.260,P = 0.000,OR = 24.750,EF = 0.411)和Cw*14(χ2= 9.720,P = 0.016,OR = 16.833,EF = 0.134)在HIV感染后长期存活人群中的频率显著高于对照组。提示A*3601、Cw*0304、Cw*14(01-03)可能对彝族人群艾滋病发病进程有一定影响,更深入的疾病关联分析将为艾滋病的发病机理提供参考。

人狂犬病毒的检测及遗传特征分析

姚文荣, 潘国强, 熊成龙, 周前富, 肖奇友, 李明慧, 张永振

2007, 22(4): 307

从浙江温州市与湖南新宁县两例病人分别采集血液与唾液,用免疫印迹法(Western Blot)检测病人血液中的抗狂犬病毒核蛋白抗体,两份病人血清均为抗狂犬病毒核蛋白抗体阳性。由于两人均未接种过狂犬病疫苗,两患者均为狂犬病。用RT-PCR法检测病人唾液,仅从温州病人的唾液中检测到狂犬病毒特异RNA。将该唾液接种乳鼠后分离到一株病毒(Zhejiang Wz0(H))。扩增Zhejiang Wz0(H)的核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因并测定核苷酸序列。系统发生分析发现Zhejiang Wz0(H)株病毒的全N及G基因与我国主要疫区及印度尼西亚的街毒株有较高的同源性;N基因的核苷酸及氨基酸的同源性分别为92.0%~97.8%与97.0%~98.4%,G基因的核苷酸及氨基酸的同源性分别为92.4%~99.4%与96.0%~99.4%;推导的N及G基因的氨基酸序列分别有8和15处氨基酸发生替换,其中G基因第332位氨基酸位于Ⅲ 抗原区。同我国现用疫苗株相比,该病毒株与CTN疫苗株关系最近,N基因的核苷酸与氨基酸的同源性分别为89.3%和97.1%,G基因的核苷酸与氨基酸的同源性分别为87.5%和92.5%。与疫苗株的氨基酸序列比较发现N及G基因分别至少有12和37个氨基酸位点不同,其中G基因上的第332、333和336位氨基酸位于能结合中和抗体的Ⅲ 抗原区。上述研究结果表明Zhejiang Wz0(H)株病毒为I型狂犬病毒,其N基因和G基因的核苷酸及推导的氨基酸序列与我国现用的狂犬病毒疫苗株存在一定差异。

利用Tn7介导的转座快速构建重组伪狂犬病毒

专芳芳, 张振锋, 徐涤平, 司艳红, 王汉中, 吾甫尔

2007, 22(4): 316

在大肠杆菌内,通过同源重组将lacZα-mini-attTn7插入伪狂犬病毒(PRV)细菌人工染色体(BAC)gG与gD基因间的非转录区,获得重组BAC pBeckerZF1。此后利用Tn7介导的转座将绿色荧光蛋白基因导入pBeckerZF1获得了pBeckerZF2。通过转染将pBeckerZF1和pBeckerZF2分别导入PK15细胞获得重组病毒vBeckerZF1和vBeckerZF2。 其中vBeckerZF1与野生型病毒vBecker3产生的细胞病变效应和病毒滴度没有明显区别。vBeckerZF2在细胞中连续传代五次后,mini-Tn7插入序列稳定地存在于病毒基因组。结果表明, Tn7介导的转座系统可以用于快速、稳定地构建重组伪狂犬病毒。该技术将大大加快重组伪狂犬病毒的构建步伐,为病毒基因结构和功能的深入研究奠定基础。

一种病毒检测芯片探针的优化设计

周卓, 窦植洵, 张忱, 于厚卿, 刘易杰, 张翠竹, 曹又佳

2007, 22(4): 326

DNA微阵列是一种具有广阔应用前景的病毒病原检测技术。然而,目前的检测阵列通常应用于部分特定的病毒变异型,因此可能产生假阴性或者不明确的结果。而覆盖所有病毒变异型的微阵列需要设计更多的探针,这将导致点阵密度及阵列生产费用的大幅增高。本文探索和开发了一种新的寡聚核苷酸探针设计策略。我们以HIV-1 tat基因为例设计了阵列探针,并通过计算机运算检验了所优化参数的有效性。结果表明,与现有方法相比,本设计所使用的寡聚核苷酸探针数显著减少,而检测特异性和探针杂交效率并不受影响。采用这种减少寡聚核苷酸探针的微阵列设计方法能够提高DNA微阵列检测能力,并且能够极大的降低微阵列芯片的制造费用。这种芯片探针设计策略和方法可以推广应用于其他病毒的检测,有很高的应用潜力。