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2007年22卷5期

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MHV-3诱导的慢性病毒性肝炎中T淋巴细胞亚群的初步研究

张江国, 覃小敏, 王晓晶, 严伟明, 罗小平, 宁琴,

2007, 22(5): 339

为了探讨3型鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus-3,MHV-3)感染C3H/Hej小鼠所致小鼠慢性肝炎模型体内T细胞亚群的动态变化。我们取C3H/Hej 小鼠90只,各腹腔注射10空斑形成单位(plaque forming unit,pfu)MHV-3,采用空斑形成单位法和组织HE染色石蜡切片法分别检测感染后0天、4天、6天、8天、9天、10天、12天、15天、20天 、25天、30天、40天小鼠肝脏组织病毒滴度及病理学的变化,采用流式细胞仪检测感染后0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、15天、20天 、25天、30天、40天小鼠外周血、脾细胞悬液及肝脏组织中T淋巴细胞亚群包括CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、CD3+CD4-CD8-T(DN Treg) 淋巴细胞、CD3+CD4+CD25-、CD3+CD4-CD25+及CD3+CD4+CD25+T淋巴细胞各自在T淋巴细胞中所占比例。我们发现 C3H/Hej小鼠于感染后2天始肝脏组织病毒滴度增高,呈现持续的病毒复制, 并呈现持续炎性改变;其外周血、脾脏、肝脏T淋巴细胞中的DN T细胞和CD4+ CD25+ T细胞比例明显升高。C3H/Hej小鼠感染MHV-3 后肝脏病毒滴度及病理改变提示该病毒可引起肝脏的慢性炎症改变,而DNT 细胞和CD4+CD25+T 细胞比例的改变提示DNT 细胞和CD4+CD25+T 细胞在MHV-3诱导的慢性病毒性肝炎的发生、发展中具有显著的负性免疫调节作用,是导致疾病慢性迁延的重要因素。

牛流行热病毒G1抗原表位基因在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定

郑福英, 蔺国珍, 邱昌庆, 原魁章, 宋军英

2007, 22(5): 347

从牛流行热病毒糖蛋白基因通过PCR合成G1抗原表位基因,克隆于表达载体pPIC9K,构建了重组载体pPIC9K-G1。线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418压力和PCR法筛选阳性重组酵母用甲醇进行诱导表达,得到较预期15.54 kDa更大的26 kDa的蛋白,经脱糖基化分析发现此蛋白进行了糖基化。通过western blot和ELISA分析,表明目的蛋白具有较好的反应活性;通过兔体免疫试验和特异性分析,表明目的蛋白具有免疫活性和较高的特异性。因此,表达蛋白可作为包被抗原,开发ELISA诊断试剂盒。

Complete Genomic Sequence of a Chinese Isolate of Duck Hepatitis Virus*

2007, 22(5): 353

The complete genomic sequence of Duck hepatitis virus 1 (DHV-1) ZJ-V isolate was sequenced and determined to be 7 691 nucleotides (nt) in length with a 5′-terminal un-translated region (UTR) of 626 nt and a 3′-terminal UTR of 315 nt (not including the poly(A) tail). One large open reading frame (ORF) was found within the genome (nt 627 to 7 373) coding for a polypeptide of 2 249 amino acids. Our data also showed that the poly (A) tail of DHV-1 has at least 22 A's. Sequence comparison revealed significant homology (from 91.9% to 95.7%) between the protein sequences of the ZJ-V isolate and those of 21 reference isolates. Although DHV-1 has been classified as an unassigned virus in the Picornaviridae family, its genome showed some unique characteristics. DHV-1 contains 3 copies of the 2A gene and only 1 copy of the 3B gene, and its 3′-NCR is longer than those of other picornaviruses. Phylogenetic analysis to do sequence homology based on the VP1 protein sequences showed that the ZJ-V isolate shares high sequence homology with the reported DHV-1 isolates (from 92.9% to 99.2%), indicating that DHV-1 is genetically stable.

新西兰兔对灭活SARS冠状病毒的体液免疫应答和组织病理学变化

张传海, 刘新建, 王一飞, 陆家海, 郑焕英, 熊盛, 张美英, 刘秋英

2007, 22(5): 360

为了评价灭活SARS冠状病毒的免疫原性,12只成年雄性新西兰兔被随机分为3组,分别用灭活病毒+佐剂、弗氏佐剂、生理盐水通过耳静脉注射进行免疫,每隔两周共接种3次。初免后第7天至第51天,耳缘静脉采血8批,分离血清,间接ELISA和微孔板细胞病变中和试验方法分别测定血清中特异性IgG抗体和中和抗体滴度的动态变化。SARS-CoV蛋白芯片检测抗体的特异性。样本组织切片通过H&E染色,显微观察其组织病理学变化。结果显示,灭活SARS-CoV可诱导兔产生有效的体液免疫反应,产生的高效价特异性IgG抗体具有中和活性。特异性IgG抗体和中和抗体的峰值滴度分别达1:40960和1:2560。在初免后第51天实验组兔的解剖脏器上,心脏、脾、肾、睾丸等器官的组织切片未有明显的组织病理学变化,肝脏有轻微的病变,而肺脏显示出显著的病理学变化,这对于SARS灭活疫苗的安全性是一个值得注意的提示。

小鼠暴发性肝炎相关基因fgl2凝血酶原酶

习东 汪之沫 高随 朱传龙 郭健文 罗小平 宁琴*, 汪之沫, 高随, 朱传龙, 郭健文, 罗小平, 宁琴

2007, 22(5): 366

为探索小鼠fgl2凝血酶原酶(mfgl2)小干扰RNA(siRNA)在体外对mfgl2凝血酶原酶基因表达的干扰效应,构建了产生mfgl2短发夹状RNA(shRNA)的载体p-mfgl2shRNA, 将其与mfgl2-EGFP融合基因表达质粒pEGFP-mfgl2共转染到CHO细胞,转染48h后,倒置荧光显微镜下观察EGFP蛋白在CHO细胞中的表达,并通过流式细胞仪检测荧光细胞阳性率。将p-mfgl2shRNA和mfgl2表达质粒pcDNA3.1-mfgl2共转染到CHO细胞和HeLa细胞,通过RT-PCR和免疫组化检测mfgl2基因转录和蛋白表达水平的变化。在CHO细胞中,含p-mfgl2shRNA的干预组较对照组的绿色荧光强度明显减弱,荧光细胞数明显减少。在CHO和HeLa两种细胞中,mfgl2shRNA显著抑制了mfgl2mRNA和蛋白质的表达。这表明 mfgl2
shRNA表达质粒p-mfgl2shRNA可在体外高效特异地抑制mfgl2基因转录和蛋白的表达,为进一步的体内实验奠定了基础。

丙型肝炎病毒核心蛋白对干扰素诱导的抗病毒基因表达的影响及其机制

常燕子, 雷延昌, 吴雯, 陈姗姗, 黄汉菊, 杨东亮, 陆蒙吉

2007, 22(5): 374

干扰素-α(IFN-α)通过激活Jak/STAT信号途径,诱导干扰素刺激基因(ISGs)表达而发挥抗病毒作用。STAT1的磷酸化是Jak/STAT通路活化的关键步骤,而SOCS3则通过抑制STAT1的磷酸化成为该通路重要的负调控因子。越来越多的证据显示HCV可以干扰IFN的抗病毒效应,但 HCV 核心蛋白是否参与该过程尚存在争议。我们研究了核心蛋白对IFN诱导的抗病毒基因表达的影响及其可能的机制。结果显示,IFN-α处理后,表达核心蛋白的HepG2细胞中PKR,MxA和2’-5’OAS的转录水平均下降,ISRE介导的萤光素酶活性也降低。进一步的研究发现,核心蛋白可以抑制STAT1的磷酸化,而激活SOCS3的表达。这些结果提示,在HepG2细胞中,HCV核心蛋白可以下调一些IFN-α诱导的抗病毒分子表达,而激活SOCS3的表达、抑制STAT1磷酸化可能是其中的机制之一。

传染性皮下及造血组织坏死病毒和桃拉综合症病毒的分子流行病学研究*

张聪, 袁军法, 石正丽*

2007, 22(5): 380

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和桃拉综合症病毒(TSV)是源于美洲的两种重要的对虾病毒,于本世纪初传入我国。本实验对从国内七个不同地区采集的214份南美白对虾样品,用PCR的方法分别检测了IHHNV和TSV的感染情况。结果显示在受检样品中IHHNV的感染率较高,达65.42%,TSV的感染率相对较低,为3.27%。同时也发现某些样品能共感染这两种病毒。从7个地区的阳性样品中扩增了大小为3kb的IHHNV基因组片段,同时也从3个地区的阳性样品中扩增了TSV结构蛋白ORF2基因,并进行了测序分析。序列比对表明与夏威夷分离株相比,IHHNV和TSV中国分离株的序列变异都很小。进化分析显示TSV分离株能分为两组:亚洲组和美洲组,表明TSV的序列变异与地理分布有显著相关性。

杆状病毒介导p35基因表达抗人胚肾细胞293凋亡﹡

宋建华, 梁昌镛, 陈新文

2007, 22(5): 389

杆状病毒由于其独特的生物学特性显示了其作为基因治疗载体的优势。本研究证明重组杆状病毒载体Ac-CMV-p35和Ac-CMV-GFP能有效地转导人胚肾293细胞,并介导外源基因高效表达,目的基因的表达水平与杆状病毒的感染剂量成正线性相关。MTT实验和细胞生长曲线测定表明,杆状病毒转导对哺乳动物293细胞既没有明显毒性又不影响细胞的繁殖。Ac-CMV-p35介导p35基因的表达能有效抑制由放线菌素D和紫外线所诱导的凋亡,并能提高293细胞抗饥饿的能力。杆状病毒介导功能基因p35在人胚肾293细胞中表达并使之具有正确的生物学功能,该结果表明杆状病毒具有成为疾病基因治疗转移载体的潜力。

草鱼呼肠孤病毒内衣壳蛋白VP6与增强绿色荧光蛋白在昆虫细胞中的构建与共表达

方勤, 戴雯, 张岚岚,

2007, 22(5): 397

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属。序列分析表明,GCRV S8片段长为1296bp,编码大小约为43kD病毒内衣壳蛋白VP6。为获得GCRV VP6与带有绿色荧光蛋白体外重组的非融合表达,本实验通过PCR扩增,分别得到编码GCRV内衣壳蛋白基s8片段及绿色荧光蛋白(GFP)特异基因条带。通过基因克隆获得重组GCRVS8与GFP基因的pFastdual双表达载体。将筛选得到的pFbDGCRVs8/eGFP 重组质粒转化DH10Bac细胞,成功得到转座的AcGCRVs8/eGFP Bacmid。将重组AcGCRVs8/eGFP Bacmid转染sf9昆虫细胞,转染后3天开始出现绿色荧光,其荧光信号第5天进一步增强与扩大,表明其重组蛋白能在sf9昆虫细胞中高效表达。子代病毒的增殖培养证实其重组病毒的高效表达的稳定特性。重组出芽病毒特异基因组PCR扩增结果,表明其双插入目的基因的正确性。本实验结果为GCRV的体外装配及进一步的结构与功能分析奠定了良好的基础。

蛋白分型:一种在蛋白水平研究流感病毒进化的新方法*

史卫峰, 张忠, 彭磊, 张彦周, 刘彬, 朱朝东

2007, 22(5): 405

系统发育分析方法被广泛应用于检测流感病毒的进化。但是,以前关于流感病毒系统发育的研究并没有充分利用蛋白水平的遗传信息,因此不能区分病毒基因之间的细微区别。蛋白分型是一种研究流感病毒进化的新方法。它旨在挖掘病毒基因在蛋白水平上潜在的遗传信息,并且使这些特有的氨基酸标记(蛋白型)可视化。本文以部分H5N1禽流感病毒的神经氨酸酶基因片段为例介绍蛋白分型方法的流程。贝叶斯分析表明神经氨酸酶的基因树大体上分为三个家系。关于神经氨酸酶的蛋白型分析进一步表明,在家系甚至某些基因型内部很可能存在着多种蛋白型,而一种蛋白型也可能包括多种基因型。特别地,神经氨酸酶蛋白型分析还表明,部分基因型的病毒可能存在一些共重配的位点。所有这些结果都证明蛋白分型方法能比系统发育分析方法提供更多的遗传信息。