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2008年23卷1期

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Review

整联蛋白活化与病毒感染研究进展

高闪电, 独军政, 周建华, 常惠芸*, 谢庆阁

2008, 23(1): 1 doi: 10.1007/s12250-008-2886-2

整联蛋白是广泛存在于真核细胞表面的完整的膜受体家族,包括由至少18种不同的α亚基及8种β亚基形成的20多种α β异二聚体,在介导血管内皮细胞和肿瘤细胞的粘附、淋巴细胞运输、肿瘤生长以及病毒感染方面都有重要的作用。对整联蛋白的结构功能及其在病毒感染中作用的研究对揭示病毒嗜性和致病机制以及抗病毒药物的设计、病毒感染的预防和治疗有重要意义,本文对此作一综述。
Research Article

SHIV-CN97001 Gp120区在恒河猴体内传代过程中的变异

刘强, 杨贵波, 马跃, 邱趁丽, 代解杰, 邢辉, 邵一鸣

2008, 23(1): 8 doi: 10.1007/s12250-008-2892-4

SHIV-CN97001在中国艾滋病疫苗免疫保护效果评价中发挥了重要作用。通过将SHIV-CN97001在中国恒河猴体内进行快速连续传代,希望得到致病性SHIV-CN97001/恒河猴艾滋病模型。本研究分析了SHIV-CN97001传代过程中gp120基因区序列变异的特点。 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对各代动物病毒载量峰值时间点血浆样品中的SHIV-CN97001 gp120基因进行扩增,连接T载体后每份样品挑选18个克隆测序,计算并分析每只动物体内病毒的基因离散率 (divergence, diversity)及每条传代线路中病毒的基因多态性。序列分析发现SHIV-CN97001在传代过程中基因离散率存在先升后降的趋势,第三代病毒基因离散率最高。基因离散率和病毒复制能力以及诱导抗体生成能力之间存在相关性。基因多态性分析发现V3区在各传代线路中均相对保守。氨基酸序列分析发现V3环顶端四肽在197个克隆中全部为GPGQ,V3环关键氨基酸的预测分析SHIV-CN97001辅助受体传代过程中未发生改变。 结果表明SHIV-CN97001经过中国恒河猴体内快速传代病毒基因离散率未出现明显上升,并且传代后期出现病毒“返祖现象”,这从分子水平上部分解释SHIV-CN97001经猴体传代未出现致病株的可能原因。

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株全基因序列的克隆、序列分析

王宇, 刘淑英, 李建, 韩敏, 王振玲

2008, 23(1): 15 doi: 10.1007/s12250-008-2876-4

绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)是引起绵羊肺腺瘤病(OPA)的主要病原,但在正常绵羊基因组内都含有与JSRV病毒密切相关的enJSRV序列。为了扩增enJSRV NM株全基因序列,参照GenBank中已发表的enJSRV的基因组全序列,设计合成七对引物,从健康无病绵羊的子宫组织中提取总DNA,分别使用enJSRV特异性探针和JSRV特异性探针,进行斑点杂交鉴定。然后用鉴定后的子宫总DNA为模板,对enJSRV-NM株基因组分7段进行PCR扩增,产物分别为7个特异性基因片段,将其分别克隆入pMD19-T载体中进行双向测序并用DNAstar软件进行序列拼接与序列分析,获得完整的enJSRV-NM株基因组全序列。结果表明,enJSRV-NM株基因组全长7942bp,有相互重叠的4个较长的开放阅读框(ORF),分别代表gag、pro、pol和env基因,此外在pol基因的3’末端重叠一个额外的开放阅读框(orf-x)。与内源性南非代表毒株enJS56A1的基因序列比较,核苷酸同源性为99.2%;与外源性美国代表株JSRV21的基因序列比较,核苷酸同源性为92.3%。分析enJSRV-NM株基因组结构,在gag 基因编码的NC区发现有2个较典型的“胱氨酸—组氨酸序列”,可形成锌指结构。在env 基因编码的TM区没有发现具有感染性JSRV所特异性的“YXXM”基序。enJSRV-NM株推导出的氨基酸与国外报道的JSRV推导的氨基酸进行同源性比较,在大多数区域同源性高达90%~98%,而有3个可变区(VR1、VR2和VR3),分别位于gag基因和env基因,gag基因内有2个可变区(VR1、VR2),另一可变区VR3位于env基因编码的TM区。这也是我国首次报道的enJSRV的全序列,这不仅为enJSRV 编码区基因的表达奠定基础,同时也为我国科研工作者进行更深入的研究绵羊肺腺瘤病得生前诊断提供理论依据。

杆状病毒口服感染因子参与棉铃虫核多角体病毒包埋型病毒粒子体外感染HzAM1细胞

姜婷, 李祥, 宋建华, 梁昌镛, 陈新文

2008, 23(1): 25 doi: 10.1007/s12250-008-2888-0

杆状病毒具有两种类型的病毒粒子,一种为出芽型病毒粒子,另一种为包埋型病毒粒子。昆虫吞食病毒多角体后,多角体在昆虫中肠碱性环境下裂解,释放包埋型病毒粒子,从而开始初始感染。由于缺失包埋型病毒粒子体外感染系统,因此感染的分子机制目前尚不清楚。在本文中,实验结果证明棉铃虫核多角体病毒包埋型病毒粒子能在体外感染HzAM1细胞,并且感染的效率受pH值的影响。感染效率最佳的pH值是8.5,该值与昆虫中肠上皮细胞的微绒毛的pH值是一致的,而微绒毛正好是病毒在体内感染的位置。抗体中和实验分析表明棉铃虫核多角体病毒四个口服感染关键基因(p74, pif-1, pif-2 和 pif-3)对于包埋型病毒粒子体外感染也是必须的。因此,这个体外感染系统可以用来分析包埋型病毒粒子的入侵机制。

一个新的辛德毕斯样病毒的分离与全序列的分析

王晶晶, 张海林, 车艳春, 王丽春, 马绍辉, 刘龙丁, 廖芸, 李琦涵

2008, 23(1): 31 doi: 10.1007/s12250-008-2891-5

辛德毕斯样病毒于1986年首次在我国分离,该基因序列全长11000多bp,编码3700多个氨基酸。其中包括了非结构区的5′端非转录区(5′-NTR)、非结构蛋白1、2、3、4区(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)、保守区(Conserved)、非保守区(Nonconserved)和结构区的核衣壳蛋白(Capsid)、结构1、2、3区(E1、E2、E3)、6K结构区(6K)、3′端非转录区(3′-NTR)我们从疑似脑炎发热病人的血液中分离病毒,经鉴定并传代后,取感染细胞的病毒上清,提取病毒RNA,用RT-PCR的方法,将其分为12个片断,再将扩增的片断连接到T载体上,通过正反向测序12个片断完成了Sindbis-IMB的全序列的测定:序列长全长11717,编码3773个氨基酸,在与其它辛德毕斯病毒比较后与同为云南分离得到的YN87448病毒株同源性最高变异率仅为1%,其次为SAAR86,变异率为1.2%。新分离到辛德毕斯样病毒的在非结构区上核酸序列变化较大,经比较发现在230、231、443、781、1582、1746位蛋白序列上出现了与其它序列完全不同的氨基酸,分别是K、E、N、R、H、L,且在nsp4末端较YN87448多出了3个氨基酸分别是谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸(Q、S、A)。

牛泡沫病毒Borf-1蛋白亚细胞定位研究

谈娟 吴凯 常锐 陈启民 耿运琪 乔文涛, 吴凯, 常锐, 陈启民, 耿运琪, 乔文涛

2008, 23(1): 37 doi: 10.1007/s12250-008-2893-3

Borf1蛋白是牛泡沫病毒(BFV)侵入细胞后早期表达的蛋白,在病毒的生活周期中起着至关重要的作用。Borf-1蛋白为DNA结合蛋白,它通过结合在病毒基因组的两类启动子LTR和IP的相应应答元件上行使其反式激活功能,调控病毒基因表达。为了研究Borf1在病毒感染过程的定位,本文通过克隆、表达并纯化可溶性Borf-1蛋白后,免疫小鼠获得高效价抗血清。通过蛋白印迹实验,与商品化标签抗体比较,结果显示抗血清可以灵敏并特异性识别真核表达的Borf1蛋白。利用获得的多克隆抗体分别首先检测了转染的Borf1蛋白在HeLa细胞中的定位,免疫荧光实验显示Borf1蛋白在HeLa细胞中呈现核浆共分布的状态。然后,进一步检测了BFV感染的胎牛肺细胞(FBL)中Borf1的定位,结果显示在BFV感染的过程中,Borf1蛋白也呈现核浆共分布状态。

HSVⅠ感染对L-02细胞mRNA修饰翻译体系的影响分析

洪敏, 车艳春, 唐桂珍, 寸韡, 张雪梅, 刘龙丁, 李琦涵

2008, 23(1): 43 doi: 10.1007/s12250-008-2903-5

Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSVⅠ)对宿主细胞mRNA修饰翻译通路的调控是一个系统的、复杂的体系,探索其具体机制将有助于了解病毒复制过程及宿主细胞的生物学改变。本课题借助比较蛋白质组学的技术平台,将HSVⅠ病毒感染的人正常肝细胞L-02与未感染细胞分别进行双向电泳作蛋白质组图,通过PDQuest软件对蛋白点定性、定量分析, 再利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定出一组与细胞蛋白质合成途径密切相关的表达差异蛋白点。其中,作为mRNA翻译所需的RPLP1蛋白和参与mRNA快速降解的KHSRP蛋白呈现上调,而可以正调控mRNA剪切的hnRNP H2蛋白则表现为下调。这些结果提示,HSVⅠ能够借助细胞调控蛋白从mRNA剪切、翻译、降解等多个角度共同影响细胞蛋白质合成过程,在病毒关闭细胞蛋白合成的同时又为病毒蛋白合成提供最佳环境。尽管上述细胞蛋白的具体作用机制还有待于进一步研究,但本课题为探讨病毒如何改变宿主蛋白合成途径提供了新的研究线索。

草鱼呼肠孤病毒VP7蛋白在原核细胞中的高效表达

张岚岚, 沈锦玉, 类承凤, 李小明, 方勤

2008, 23(1): 51 doi: 10.1007/s12250-008-2921-3

序列分析表明 GCRV S10 片段长为909核苷酸,编码一个分子量为34kDa 的外衣壳蛋白VP7。为获得体外表达的外衣壳蛋白,通过RT-PCR扩增,得到一条特异的、大小约0.9 kb的草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白片段;将其扩增片段克隆于含T7启动子的高效原核表达系统pRSET载体质粒,转化BL21(DE3)lysS 感受态细胞,获得重组表达菌株(pR/GCRV-VP7)。酶切重组克隆子及序列分析实验证实,所得重组克隆为目的基因插入序列。pR/GCRV-VP7表达菌株经IPTG诱导培养,SDS-PAGE结果显示,表达产物的蛋白分子量约37kDa,为目的表达融合蛋白。高效表达的融合蛋白以包含体形式存在,目的蛋白的表达量占总菌体量的60%以上。Westerblot分析表明,该表达产物与鼠抗Histag与兔抗GCRV抗体呈阳性反应。该结果为GCRV-VP7结构与功能分析奠定了基础。

云南大理乙型肝炎病毒感染的基因型和亚型研究

李威, 申元英, 张烜榕, 任来峰, 李强, 沈茹, 赵海平

2008, 23(1): 57 doi: 10.1007/s12250-008-2923-1

本研究采用了HBV基因型特异性引物分型法和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分别对云南大理白族人群100例慢性HBV感染者进行HBV基因型和亚型研究。结果显示,100份血清标本中,B型41例(41%),全部为Ba亚型,未发现Bj亚型;C型25例(25%),其中Cs亚型21例(84%),Ce亚型3例(12%),未能分型1例(4%);B+C 混合型34例(34%)。基因型B,C和B+C的分布在年龄和性别的构成无显著性差异(P=0.182;P=0.812);在HBeAg阳性或HBeAb阳性的感染者中,HBV基因型的分布均无显著性差异(P=0.077;P=0.663)。研究表明,云南大理白族人群慢性HBV感染者中存在HBV的B型、B+C混合型和C型,其中B型是该人群的HBV优势基因型;基因亚型以Ba和Cs亚型为主要流行株。最显著的特点是B+C混合型感染占很大比例。
Brief Reports

室内养殖刺参的病毒和细菌感染引发的综合症的研究

周遵春, 王年斌, 刘畅,

2008, 23(1): 63 doi: 10.1007/s12250-008-2863-9

2004年12月~2005年4月,大连市附近的室内养殖刺参发生以排脏和体壁溃烂为主要症状的疾病,伴有严重的死亡。超薄切片观察,发现患病的和将死的刺参的水管系统及消化道等处细胞的胞质中有球状病毒颗粒,直径为75~200 nm。负染法检测结果表明,凡患病的海参体内皆含此种病毒粒子,而非发病区的海参体内未检出病毒粒子。另从病海参组织中分离出2株细菌。人工感染试验结果表明,单独的病毒浸染或病毒和2株细菌混合浸染,皆可使受试海参产生与自然症状相似的病变,引起90%~100%的死亡。单独的细菌浸染,受试海参的发病率约30%~80%,死亡率约20%。经负染检测,各受试组动物中,只有暴露于含病毒介质的动物体内检出病毒粒子。组织病理观察结果是,水管系统的肌肉和上皮细胞、呼吸树、消化道的结缔组织和上皮细胞等出现核固缩、内质网和线粒体解体等现象。

罗氏沼虾诺达病毒的卫星病毒的体外表达和装配机制的研究

王建民 张化俊 石正丽, 张化俊, 石正丽

2008, 23(1): 73 doi: 10.1007/s12250-008-2926-y

极小病毒(Extra Small Virus, XSV)是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus, MrNV)的卫星病毒,其基因组编码两个同框衣壳蛋白CP17和CP16。本文首先在昆虫和原核系统表达VP17蛋白, 证明CP16由CP17基因的第二个起始密码子AUG独立起始翻译,而不是CP17的蛋白酶降解产物。其次在大肠杆菌表达CP17和一系列截短的CP17,结果证明CP17的C端在类病毒颗粒形成过程中扮演重要角色。

一对用于BTV群NS1基因通用检测的独特引物

尹惠琼, 张改平, 张红, 章金刚

2008, 23(1): 68 doi: 10.1007/s12250-008-2901-7

目前蓝舌病病毒(BTV)已发现25个血清型。对BTV进行快速、可靠的群特异性检测极为重要,因此本研究设计了适用于BTV群特异性检测的一对独特引物,并进行了评价。利用DNAstar软件对不同血清型BTV保守基因VP7及NS1分别进行序列比对,发现NS1基因的5’端为最保守片段,针对BTV保守基因的保守片段设计了一对通用型引物。Blast软件分析引物与GenBank发表的病毒基因的同源性,显示引物特异性较好;利用8个不同血清型BTV标准毒株进行RT-PCR检测,证实该引物能有效检测不同血清型BTV;通过BTV1-12和EHDV1-4进行检测,证实该引物具有较好的检测特异性;通过制备的含特检序列的质粒标准品P121进行检测,显示该引物检测的敏感性为105 copies,重复检测CV%为0;对模拟血清样品进行检测,结果均为阳性。所设计的特异性引物可用于不同血清型BTV NS1基因的通用型检测。