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2009年24卷6期

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Review

CD4+T淋巴细胞大规模死亡与异常免疫激活——艾滋病致病进程的推动力*

李昌, 胡勤学

2009, 24(6): 501 doi: 10.1007/s12250-009-3063-y

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虽然HIV侵入后,宿主将经历数年乃至数十年的潜伏感染期,但是绝大多数感染者不可避免地发展成艾滋病,最终导致死亡。本文通过综述肠相关淋巴组织的特殊组织结构、CD4+T细胞的死亡原因、致病性与非致病性免疫缺陷病毒感染之间的异同、机会感染与免疫激活的相互影响、疾病进程的指示症状、以及HIV感染的总体疾病进程,探讨了推动艾滋病进程的两大重要致病机制:急性期肠相关淋巴组织中CD4+T细胞的大量死亡以及潜伏期慢性免疫激活。

乙肝病毒反转录酶的结构特征和分子机理*

冯辉, 胡康洪

2009, 24(6): 509 doi: 10.1007/s12250-009-3076-6

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乙肝病毒属嗜肝DNA病毒科,能引起宿主感染B型肝炎,造成全球严重的公共卫生问题。包含有DNA的病毒颗粒通过反转录方式实现其基因组的复制,该步骤是通过病毒编码的反转录酶完成的。因此,反转录酶在病毒生活周期中起着至关重要的作用。本文总结了目前所了解的乙肝病毒反转录酶的结构特征和分子机理,对该问题的深入探索在乙肝病毒基础研究和药物开发二方面具有理论和应用指导意义。

Research Article

一种在大肠杆菌中高效表达、纯化HIV-1 Tat蛋白的改进方法*

张士猛, 樊嵘, 杨天一, 孙薏, 李敬云, 徐勤枝, 周平坤

2009, 24(6): 518 doi: 10.1007/s12250-009-3068-6

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内源性Tat蛋白的功能在过去20年中已经被很好的阐明,但是外源性Tat蛋白的功能则研究进展缓慢,这主要是因为大规模制备Tat蛋白有困难。我们实验室从艾滋病人血清中PCR扩增到了全长tat基因。稀有密码子分析显示tat基因的密码子有14%是大肠杆菌的稀有密码子,特别是连续的ARG密码子。Tat在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达极少,但是在补充了六种稀有tRNA(Arg, Leu, Ile, Pro)的Rosetta-gami B(DE3)菌株中则非常高效的表达。带有His6标签的Tat蛋白以可溶形式表达,并且可以形成不依赖于半胱氨酸二硫键的二聚体。MALDI-TOF质谱也证实了该蛋白的纯度及分子量。报告基因分析也证实该重组蛋白具有反式激活活性。因此,本实验室提供的方法为深入研究外源Tat蛋白的功能打下了很好的基础。

狂犬病毒中国分离株SH06与疫苗株全基因组序列的比较*

孟胜利, 徐葛林, 吴杰, 杨晓明, 严家新

2009, 24(6): 529 doi: 10.1007/s12250-009-3030-7

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在本研究中,我们从一只疯狗中分离到狂犬病毒街毒株(SH06)并进行了全基因组测序和分析。SH06基因组共有11924个核苷酸,与其它参考疫苗株相比,核苷酸序列同源性从82.2% (PV株) 到86.9%(CTN株);与来自GenBank的其它狂犬病毒全基因组序列进行系统进化分析,结果表明SH06与中国疫苗株CTN亲缘关系最近。

CXCR3相关趋化因子在3型鼠肝炎病毒诱导的暴发性肝衰竭中的作用

邹勇, 宋戈, 鲍俊杰, 丁琳, 陈韬, 王洪武, 严伟明, 王小晶, 罗小平

2009, 24(6): 537 doi: 10.1007/s12250-009-3071-y

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趋化因子在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的暴发性肝衰竭中的作用仍然没有被很好的阐明。此项研究我们探讨了CXCR3相关趋化因子( CXCL9和CXCL10)在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝衰竭淋巴细胞在肝脏的募集及随后的肝衰竭中的作用。6-8周龄雌性Babl/cJ 小鼠腹腔注射100PFU(MHV-3), 采用流式细胞术检测感染MHV-3 48h后的Babl/cJ小鼠肝脏、脾脏和外周血T淋巴细胞和NK细胞的比例、数量以及其表面趋化因子受体CXCR3的表达频率。实时定量PCR技术检测感染MHV-3 0、24、48和72 h后的Babl/cJ小鼠肝内趋化因子CXCL9和CXCL10 mRNA的表达水平。Transwell细胞迁移实验验证感染的肝细胞对淋巴细胞的趋化作用以及趋化因子CXCL10在其中的作用。Babl/cJ小鼠感染MHV-3后,肝脏T细胞和NK细胞的数量显著上升,并且其表面趋化因子受体CXCR3的表达也显著上调。实时定量PCR检测证实,感染MHV-3 48h后,肝内趋化因子CXCL9和CXCL10 mRNA水平也显著升高。体外Transwell实验证实感染的肝细胞对T细胞和NK细胞具有明显的趋化作用,并且这种趋化作用能被抗-CXCL10单克隆抗体显著阻断。这些结果表明CXCR3相关趋化因子(CXCL9和CXCL10)在MHV-3诱导的暴发性肝衰竭中淋巴细胞在肝脏的募集及随后的坏死性炎症和肝衰竭中发挥着重要作用。

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5在原核细胞中的表达及其免疫原性分析

张岚岚, 沈锦玉, 类承凤, 范超, 郝贵杰, 方勤

2009, 24(6): 545 doi: 10.1007/s12250-009-3038-z

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草鱼呼肠孤病毒(GCRV)隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属。成熟的病毒粒子为双层衣壳,其基因组由11条双链RNA组成。序列分析和三维重构研究显示, GCRV和哺乳动物呼肠孤病毒MRV在结构蛋白组成上具有很高的序列同源性。为了探讨该病毒的致病机理,我们在大肠杆菌中表达了MRV衣壳蛋白μ1的类似物GCRV VP5蛋白。结果显示,高效表达的His-tag融合蛋白以包含体形式存在。Westernblot分析表明,表达的His-tag融合蛋白与兔抗GCRV抗体呈阳性反应。此外,我们用纯化的表达蛋白免疫小兔获得了抗血清,ELISA实验证实表达的VP5蛋白具有较高的免疫原性。该结果为进一步研究GCRV外衣壳蛋白VP5进入细胞的机制以及在感染过程中与病毒蛋白和宿主细胞的相互作用奠定了基础。

HCMV感染抑制人海马神经前体细胞向星形胶质细胞分化*

李玲, 王斌, 李鹏, 白志强, 王海涛, 刘海燕, 钱冬萌, 宋旭霞, 丁守怡, 闫志勇, 姜光域

2009, 24(6): 552 doi: 10.1007/s12250-009-3019-2

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人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)引起人类先天性脑疾病的重要病原体,迄今为止,HCMV引起神经损伤的机制尚未阐明,本实验旨在研究HCMV感染对体外培养的人海马源性神经前体细胞(neural Precursor cells,NPCs)分化的影响。我们在体外分离、培养了人海马NPCs,并通过免疫荧光方法检测其标志物-巢蛋白(Nestin)的表达对其进行鉴定。随后在含10%胎牛血清的培养条件下,诱导NPCs向星形胶质细胞分化,同时以MOI为5的HCMV AD169株感染NPCs, 7d后使用免疫荧光方法检测HCMV即刻早期蛋白IE和晚期蛋白pp65证实其感染的建立;使用激光共聚焦显微镜免疫荧光方法检测Nestin和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,计算阳性细胞比率。免疫荧光检测显示本实验所培养的细胞(4-8代)95%±8%表达Nestin,表明其是NPCs;分化诱导7d后,感染组细胞表达IE和pp65, 感染组和对照组Nestin阳性率分别为93%±10%和50%±19%(t=6.03 ,p<0.01),GFAP阳性细胞率分别为55±17% 和81%±11%(t=3.77,p<0.01)。本实验的数据证明分化过程中的NPCs是HCMV的容许细胞;HCMV感染可以抑制NPCs向星形胶质细胞分化,这可能部分解释先天性巨细胞病毒感染导致脑发育异常的机制。

狂犬病病毒街毒株反向遗传系统辅助质粒的构建及鉴定*

明平刚, 黄莹, 唐青, 杜加亮, 陶小燕, 严家新, 扈荣良

2009, 24(6): 559 doi: 10.1007/s12250-009-3039-y

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利用分子克隆的方法,将狂犬病毒街毒株的N、P、G和L基因克隆到真核表达载体pVAX1上,构建出cDNA真核表达质粒,用酶切及测序的方法鉴定所构建的克隆,同时选构建好的N基因的克隆进行蛋白的表达并用免疫荧光进行检测,检测结果表明,成功构建了狂犬病毒反向遗传系统所需的辅助质粒。

抗口蹄疫病毒O/China99毒株VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定*

宋帅, 林彤, 邵军军, 高闪电, 丛国正, 独军政, 常惠芸

2009, 24(6): 566 doi: 10.1007/s12250-009-3061-0

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用口蹄疫病毒O/China99毒株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合。采用免疫组化试验进行阳性杂交瘤细胞株的筛选,并对获得的单抗进行特异性、中和性和抗原识别位点的分析。结果显示,获得了两株稳定分泌抗O/China99毒株抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A9和9F12;获得的两株单抗可与O/China99毒株反应而不与亚Ⅰ毒株反应,显示了良好的特异性;微量细胞中和试验中单抗1A9和9F12的中和滴度分别为640和1280;单抗1A9和9F12的重链分别为IgG1亚类和IgM亚类,其轻链均为κ亚类;两株单抗与VP1蛋白以及VP1蛋白上20(141-160)个氨基酸组成的多肽均具有反应性。此特异性单抗的获得将为口蹄疫病毒疫苗的研究、诊断方法的建立、病原学和免疫学的研究奠定基础。

中国西藏小反刍兽疫病毒的RT-PCR确诊及遗传进化分析*

赵文华, 杨仕标, 韩建强, 蒋梅, 李华春, 张念祖, 李琦涵

2009, 24(6): 573 doi: 10.1007/s12250-009-3064-x

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本研究对发生在2007年中国西藏的小反刍兽疫,采用巢式RT-PCR进行确诊并进行了遗传进化分析。研究结果显示:所检测11个样本均为PPR阳性,其中,2个测序样本同谱系I毒株Nigeria 75/1﹙X7443﹚同源性相近,3个样本同谱系IV毒株Sungri96﹙AY560591﹚具较近的同源关系;通过测定其中一株主要编码基因N/M/F/H全长读码框,发现其同毒株Sungri96的核苷酸序列同源性分别为96.6%、97.3%、97.6% 和98%。本研究结果显示中国西藏小反刍兽疫至少存在2种不同的传播来源。