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2010年25卷2期

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Review

病毒蛋白在细胞核与细胞质之间的穿梭

丁琼, 赵磊, 郭洪, 郑春福

2010, 25(2): 79 doi: 10.1007/s12250-010-3099-z

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分子依据其大小通过被动扩散和主动运输机制进入细胞核。小于50-60 kDa或的直径小于10 nm的小分子可以通过核孔复合体(NPC)被动扩散进入细胞核,但是大多数蛋白是通过能量驱动的主动运输机制进入细胞核。病毒蛋白的主动运输由核定位信号(NLS)介导。NLS在SV40大T抗原鉴定出来,后来在许多病毒蛋白中发现了NLS。通常NLS含有赖氨酸或精氨酸残基片段。输入蛋白超家族(importin α和importin β)的蛋白识别NLS,并利用Ran-GTP来调节跨核膜的运输。目前已知的病毒蛋白中核输出信号只有富亮氨酸核输出信号一种。Ⅰ型染色体区域维持物(CRM1)通过识别富亮氨酸核输出信号介导许多病毒蛋白的核输出。

Research Article

猪Ⅱ型圆环病毒截短衣壳蛋白片段的原核表达及潜在应用研究

娄忠子, 李志勇, 王刚, 李建强, 兰 喜, 李学瑞,

2010, 25(2): 86 doi: 10.1007/s12250-010-3111-7

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本研究针对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)衣壳蛋白基因(ORF2)设计3对特异性引物,分段扩增ORF2中包含大部分NLS片段的F2-1以及去NLS的片段F2-2和XF2-2,将所得片段亚克隆到pET-32a载体中,分别构建融合表达载体。将表达载体分别转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,所得表达蛋白进行Western blotting和ELISA检测,确定与PCV-2阳性血清反应较强的片段,纯化后免疫SPF兔制备多克隆抗体。选择的表达蛋白及由其制备的多克隆抗体分别用于ELISA 方法检测PCV-2抗体,IFA及IPMA方法检测PCV-2在PK-15细胞内的增殖。试验得到大小为35.9 kDa,33.6 kDa和38.6 kDa左右的融合蛋白,表达蛋白均能与PCV-2阳性血清发生反应,His-XF2-2表达蛋白与阳性血清的反应较强。用表达蛋白作为抗原包被后进行的ELISA检测显示山东部分地区的PCV-2平均抗体阳性率为27.7%(73/264)检测;IFA和IPMA检测结果显示培养PCV-2病毒的PK-15细胞中散在大量的荧光和针对病毒蛋白的阳性信号。结果提示,本研究成功对PCV-2的ORF2基因的进行了分段原核表达,His-XF2-2表达蛋白与猪PCV-2阳性血清的反应最强,蛋白及其相应的多克隆抗体具有良好的病毒感染检测效果。

EV71 C4亚型不同流行株的生物学特性比较

王丽春, 唐松青, 李艳梅, 赵红玲, 董承红, 崔萍芳, 马绍辉, 廖芸, 刘龙丁

2010, 25(2): 98 doi: 10.1007/s12250-010-3102-8

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比较分析我国不同地区来源的EV71毒株的生物学特征及其遗传学背景,是研发针对我国人群具有保护意义的疫苗的重要工作基础。对前期分离自我国阜阳、合肥、昆明、深圳的五株EV71毒株,其分别名为FY-23、FY-22、H44、K9、S1的测序后分析表明,五株病毒均属于C4亚型, VP1基因的遗传距离分析提示,这五株分离株与国内报道的其他EV71毒株具有较近的亲缘关系及很高的遗传相似性;生长动力学试验表明,这五株分离株在Vero细胞上表现出了相似的生长增殖趋势;同时,噬斑实验表明他们在Vero细胞上形成的噬斑形态没有明显差别。但交叉中和试验和免疫原性分析实验呈现它们具有的一定差异;同时,五株分离株在对新生小鼠的致病能力也呈现了较大的差异。这些不同地区EV71流行株在生物学特性方面的相似性及其差异,可为EV71疫苗的研发提供相应的依据。

秋海棠总生物碱体外抗单纯疱疹病毒I型活性研究

任哲, 张传海, 王连军, 崔蕴霞, 戚仁斌, 杨崇仁,

2010, 25(2): 107 doi: 10.1007/s12250-010-3092-6

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单纯疱疹病毒I型(HSV-1)在世界范围广泛传播,人类是其唯一宿主,因此急需开发新的药物防治HSV-1感染。秋海棠是一种传统的中草药,具有抗炎、抗肿瘤及抗生育等多种药理活性,其主要药用部位根大约含1%的生物碱,我们应用CPE法、空斑减数分析、RT-PCR等方法检测了秋海棠总生物碱体外抗HSV-1活性。在Vero细胞中,秋海棠总生物碱CC50 为46.6μg/mL,IC50为6.5 μg/mL;在6.25~12.5 μg/mL的作用浓度下,其空斑抑制率达到了55%~75%,优于同浓度下的阳性药物阿昔洛韦。RT-PCR检测发现,秋海棠总生物碱可有效抑制HSV-1病毒早期基因UL30、UL39以及晚期基因US6的表达,抑制率分别为74.6%、70.9%和62.6% 。以上结果说明秋海棠总生物碱体外具有很好的抗HSV-1病毒活性。

BFV Gag蛋白抗血清的制备及BFV细胞定位的初步研究

王健, 郭红彦, 贾瑞, 许璇, 谈娟, 耿运琪, 乔文涛

2010, 25(2): 115 doi: 10.1007/s12250-010-3110-8

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病毒是严格的细胞内寄生生物, HIV-1、HFV、HSV等病毒可以利用细胞机制进行胞内运输。牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)属于反转录病毒科泡沫病毒亚科,其胞内运输机制尚不明确。本文将BFV gag基因克隆入原核表达载体pET28a中,纯化得到了变性的Gag蛋白,用于免疫BALb/c小鼠获得抗血清,进行了Western blot杂交和免疫荧光实验。实验结果表明抗血清可以特异性识别BFV感染细胞中的Gag蛋白:在BFV的感染过程中, Gag蛋白同时发生优先剪切和非优先剪切。随后,用此Gag抗血清初步分析了包装中BFV的亚细胞定位:通过免疫荧光实验观察到BFV在微管上的定位,表明BFV在宿主细胞中可能沿着微管完成正向运输。进一步微管解聚实验证实BFV需要微管辅助完成有效复制。上述研究结果暗示BFV进化出利用宿主细胞骨架系统完成自我复制的机制。

草鱼呼肠孤病毒非结构蛋白NS38的分子特性

邵玲, 范超, Ewa Maj, 方勤

2010, 25(2): 123 doi: 10.1007/s12250-010-3115-3

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病毒非结构蛋白(包括包膜病毒和无包膜病毒)在病毒的复制和组装等过程都中扮演着极其重要的作用。和其他呼肠孤病毒一样,草鱼呼肠孤病毒的非结构蛋白NS38可能与其另一种非结构蛋白NS80相互作用,从而使得病毒颗粒的组装得以正常进行。本文首次报道了在大肠杆菌中实现了完整的NS38蛋白的诱导表达及其特性研究结果。实验结果表明,加入相同浓度的IPTG诱导,NS38蛋白在28°表达的量要明显高于同等条件下37°的表达量。此外,用纯化的NS38蛋白免疫小兔获得抗NS38的特异性抗血清。Western blot结果表明采用抗NS38的特异性抗血清能检测出GCRV感染CIK细胞裂解液中NS38蛋白的表达情况,而纯化的病毒颗粒无免疫交叉反应,证实NS38蛋白为病毒非结构蛋白。上述结果将为深入研究dsRNA病毒复制组装过程中蛋白-蛋白相互作用以及蛋白-RNA的相互作用奠定基础。

进口肉用型祖代鸡A亚群禽白血病病毒的分离和鉴定

张青婵, 赵冬敏, 郭慧君, 崔治中

2010, 25(2): 130 doi: 10.1007/s12250-010-3095-3

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通过接种DF-1细胞系,从240只一日龄进口的白羽祖代肉用型鸡中分离到一株外源性禽白血病病毒(ALV) SDAU09C1。将SDAU09C1接种无ALV感染的鸡可诱发产生对ALV-A或B的抗体反应。分离株SDAU09C1的gp85氨基酸序列与已发表的不同亚群的ALV参考株的同源性比较表明, SDAU09C1与6株A亚群参考株的同源性在88.8- 90.3%之间,远高于对其它亚群的同源性,根据gp85序列的系统发生树,该毒株属于A亚群禽白血病病毒。这是第一次报道从直接进口的祖代肉鸡中分离到A亚群禽白血病病毒。

利用以荧光素酶为报告基因的指示细胞系定量检测牛免疫缺陷病毒

姚雪, 郭红彦, 刘畅, 杜建森, 梁昊岳, 耿运琪, 乔文涛,

2010, 25(2): 137 doi: 10.1007/s12250-010-3109-1

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为了在细胞水平定量检测牛免疫缺陷病毒(bovine immunodefiency virus,BIV)的感染,我们建立了以荧火虫荧光素酶为报告基因的牛免疫缺陷病毒的指示细胞系。此细胞系为基因组中整和有BIV LTR启动子控制下的荧火虫荧光素酶报告基因的幼仓鼠肾细胞。当BIV感染指示细胞系,其反式激活因子Tat激活LTR启动子,诱导下游报告基因的表达,通过检测报告基因产物荧光素酶的活性可对BIV的感染进行定量检测。与传统的检测病毒感染的方法相比,基于BIVL的方法比观察细胞病变的方法灵敏10倍,与检测病毒衣壳蛋白的western-blot方法灵敏度相当。该细胞系可特异指示BIV感染。BIV感染与荧光素酶表达水平是时间依赖的,最佳检测时间是感染后60小时。BIVL的荧光素酶活性与BIV衣壳蛋白表达水平正相关。BIV感染复数与指示细胞系的荧光素酶活性成线性关系。综上所述,BIV指示细胞系是简便、灵敏、定量检测BIV感染的方法。

BRIEF REPORT

NAS制剂对H9N2亚型禽流感病毒感染鸡的保护试验

尚若锋, 梁剑平, 那中元, 杨红军, 刘宇, 华兰英, 郭文柱, 崔颖, 王玲

2010, 25(2): 145 doi: 10.1007/s12250-010-3082-8

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利用NAS制剂通过对28日龄雏鸡的攻毒保护试验、应用血凝试验和RT-PCR检测方法来探讨该中药制剂在动物体内对H9N2亚型禽流感病毒的抑制作用。结果表明:以0.2g/kg/d和0.1g/kg/d的剂量NAS制剂原粉对感染了H9N2亚型禽流感病毒的鸡给药3d后,在攻毒感染后第7天体内就检测不到H9N2亚型禽流感病毒。