近日，宾夕法尼亚州立大学胡建明教授团队在乙肝病毒共价闭合环状DNA（CCC DNA）合成中间体领域取得重要进展。他们成功发现了一个有着闭合环状负链和非闭合未加工正链组成的RC DNA中间体(closed minus-strand RC DNA, cM-RC DNA)。后续分析表明在这个闭合负链RC DNA中间体中，至少有部分正链DNA的5’末端依然连接有RNA引物，暗示了负链DNA的闭合很可能发生在正链DNA加工之前。相关成果发表在国际大刊Journal of Virology上，原文标题为“Identification of Intermediate in Hepatitis B Virus CCC DNA Formation and Sensitive and Selective CCC DNA Detection”。

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus , HBV, 乙肝病毒)共价闭合环状(covalently closed circular， CCC)DNA是编码所有乙肝病毒RNA的唯一模板，它对病毒复制的起始和维持是必需的。经由多个尚未解明的加工程序，双链均未共价连接的松弛环状(relaxed circular， RC)DNA形成了双链共价连接的CCC DNA。为了进一步了解CCC DNA的形成过程，检测CCC DNA形成过程中可能存在的中间体，我们使用了3’端核酸外切酶Exonuclease I和Exonuclease III，用于降解所有含开放3’端的DNA而保留单链(single-stranded)或双链(double-stranded)的闭合环状DNA。结果表明，我们成功发现了一个有着闭合环状负链和非闭合未加工正链组成的RC DNA中间体(closed minus-strand RC DNA, cM-RC DNA)。后续分析表明在这个闭合负链RC DNA中间体中，至少有部分正链DNA的5’末端依然连接有RNA引物。这暗示了负链DNA的闭合很可能发生在正链DNA加工之前。 此外，这种核酸酶处理方法能够降解闭合环状DNA以外的所有病毒DNA，因此此法改进并提升了CCC DNA PCR检测的敏感性和特异性。应用与此类似的处理方法或许能够鉴定出其他的CCC DNA形成中间体，以帮助我们进一步阐明CCC DNA形成相关的细胞因子及其形成机制，并为研发能够彻底清除乙肝病毒的药物提供更多实验依据。
 

图一 RC DNA形成CCC DNA的中间体－闭合环状负链的RC DNA（cM-RC DNA）。

研究背景

全世界大概有20亿人被乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染过，这其中又有至少2500万人发展为慢性乙肝病毒感染。慢性乙肝病毒感染者发生肝纤维化，肝硬化以及肝细胞癌的风险远高于常人，这些疾病每年会导致约65万人死亡。目前对乙肝病毒感染的治疗方法主要是使用能够特异性识别病毒逆转录酶(reverse transcriptase，RT)的核苷酸类似物(nucleoside analogues， NAs)。这些药物能够高效的抑制乙肝病毒前基因组(pregenome, pg)RNA的逆转录而阻断RC(relaxed circular) DNA的合成，从而显著减少血液内病毒颗粒的水平。然而即使经过多年的药物治疗，慢性乙肝病毒感染患者依然极少痊愈。这是因为共价闭合环状(covalently closed circular， CCC)DNA使得乙肝病毒能在病人体内形成持续感染，并且不能清除。CCC DNA由RC DNA经过多个尚未解明的步骤加工而成，但人们对CCC DNA的形成机制和相关细胞因子所知甚少。现在我们在RC DNA形成CCC DNA的过程中成功检测到了一个极有可能的中间体，这将会为CCC DNA的形成机制研究提供重要的提示。应用与此类似的处理方法或许能够鉴定出其他的CCC DNA形成中间体，这为我们阐明CCC DNA的形成机制并并为药物研发提供靶点有着重要的意义。此外, 我们提出的这种中间体检测方法还能提高CCC DNA检测的敏感性和特异性，而这一直是CCC DNA相关研究的难点所在。

第一作者罗俊，武汉大学生命科学学院微生物学博士毕业，现为胡建明教授课题组博士后。胡建明团队崔秀吉博士，上海罗氏创新中心高璐博士对此研究均有贡献。

通讯作者简介：

通讯作者胡建明教授，宾夕法尼亚州州立大学博士毕业，博士生导师。现任宾夕法尼亚州立大学微生物与免疫学系教授。在病毒与宿主相互关系、乙肝病毒组装、复制和持续感染机理领域有系统的研究和突出的建树，曾首次阐明了热激蛋白（Hsp90）与乙肝病毒逆转录酶结合促进核糖核蛋白复合体（RNP Complex）的形成从而促进病毒复制与组装（PNAS, 1996）。已在PNAS、 EMBO J、PLoS Pathogens、JVI等著名刊物发表70余篇论文，文章共被引2100多次。